ACK-Lysepuffer

Der ACK-Lysepuffer ist chemisch einfach aufgebaut. Drei gelöste Stoffe in Wasser, auf physiologischen pH-Wert eingestellt:

Standard-ACK-Lysepuffer 1X, pro 1 Liter

Über eine 0.22 µm Membran filtrieren. Bei 2-8 °C vor Licht geschützt lagern oder bei 15-30 °C, wenn das Produkt für Umgebungstemperatur ausgelegt ist; prüfen Sie das Etikett, denn kommerzielles ACK wird unter beiden Bedingungen verkauft.

Kommerzielle Formulierungen unterscheiden sich geringfügig, und diese Unterschiede sind real. Die veröffentlichte Gebrauchsanweisung von Lonza gibt NH4Cl mit 8024 mg/L, KHCO3 mit 1001 mg/L und EDTA.Na2.2H2O mit 3.722 mg/L an — ein zehnfach geringerer EDTA-Gehalt als die 0.1 mM, die in den meisten veröffentlichten Rezepturen erscheinen. Der ACK Lysing Buffer von Gibco ist mit pH 7.0-7.7 und einer Osmolalität von 280-320 mOsmol/kg spezifiziert, und der Ammoniumchloridgehalt wird oft mit 155 mM statt 150 mM angegeben. Keiner dieser Unterschiede ist groß genug, um das Verhalten des Puffers in der Praxis zu ändern; wenn Sie jedoch eine publizierte Methode exakt reproduzieren, verwenden Sie die dort genutzte Rezeptur, statt anzunehmen, jedes ACK sei identisch.

Das EDTA ist die Komponente, nach der am häufigsten gefragt wird. Es liegt in einer komplexierenden, nicht in einer lysierenden Konzentration vor: Es bindet zweiwertige Kationen, um kationenabhängige Aggregatbildung zu verhindern und die Leukozytensuspension einzelzellig zu halten. Zur Lyse selbst, die vom Ammoniumchlorid getragen wird, trägt es praktisch nichts bei.

Eine Anmerkung zur "10X"-Frage. ACK wird normalerweise als 1X geliefert und eingesetzt. Manche Anbieter verkaufen ein 10X-Konzentrat, das vor Gebrauch in Wasser verdünnt wird. Eine 10X-Stammlösung ist nicht isoton und darf niemals unverdünnt auf Zellen gegeben werden.

Die Selektivität von ACK beruht nicht darauf, dass Erythrozyten zerbrechlich wären. Sie ist die Folge zweier Proteine, die reife Erythrozyten in enormer Menge tragen und Leukozyten nicht.

Ammoniumchlorid steht in Lösung im Gleichgewicht mit Ammoniak und Protonen. Ungeladener Ammoniak durchquert die Erythrozytenmembran frei. Im Zellinneren nimmt er ein Proton auf und wird zu Ammonium, verbraucht dabei intrazelluläre Protonen und verschiebt das von der Carboanhydrase katalysierte Gleichgewicht zwischen Kohlendioxid und Bicarbonat. Erythrozyten besitzen eine sehr hohe Carboanhydrase-Aktivität, sodass sich dieses Gleichgewicht schnell einstellt.

Das entstehende Bicarbonat wird anschließend gegen extrazelluläres Chlorid getauscht, und zwar durch Bande 3 (AE1), den Anionenaustauscher der Erythrozyten, der in etwa einer Million Kopien pro Zelle vorliegt und einen elektroneutralen Eins-zu-eins-Austausch von Bicarbonat gegen Chlorid katalysiert. Das Nettoergebnis dieses als Jacobs-Stewart-Zyklus bekannten Kreislaufs ist eine fortlaufende Nettoanreicherung von Ammoniumchlorid im Zellinneren. Osmotisch gebundenes Wasser folgt, die Zelle schwillt an, und die Membran versagt.

Leukozyten besitzen weder die Carboanhydrase-Aktivität noch die Bande-3-Dichte, um diesen Zyklus in nennenswertem Tempo zu betreiben. Sie nehmen etwas Ammoniak auf und erfahren einen vorübergehenden Anstieg des intrazellulären pH-Werts, reichern aber gelöste Stoffe nicht schnell genug an, um innerhalb der wenigen Minuten des Protokolls anzuschwellen und zu platzen. Genau deshalb ist das Timing so wichtig: Der Unterschied zwischen einem roten und einem weißen Blutkörperchen in ACK ist kinetisch, nicht absolut. Lässt man die Zellen lange genug darin, leiden auch die weißen.

Aus dem Mechanismus folgen unmittelbar zwei Konsequenzen. Erstens läuft die Lyse bei Raumtemperatur schneller ab als auf Eis, weil jeder Schritt des Zyklus temperaturabhängig ist; ein gekühlter Puffer ist der häufigste Grund dafür, dass die Lyse unvollständig erscheint. Zweitens ist die vorübergehende intrazelluläre Alkalisierung, die Leukozyten erfahren, biologisch nicht neutral. Für funktionelle Messgrößen, die auf den zytosolischen pH-Wert reagieren — etwa Calciumflux, oxidativer Burst oder Phagozytose-Assays —, ist eine Dichtegradiententrennung oft die sicherere Wahl als die Ammoniumchlorid-Lyse.

Dies ist die Standardanwendung, für die ACK entwickelt wurde. Die folgenden Volumina gelten für die Milz einer adulten Maus.

1. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor. Drücken Sie das Gewebe mit dem Stempel einer Spritze durch ein 70 µm Zellsieb in kaltes PBS oder serumfreies Medium. Spülen Sie das Sieb nach.
2. Pelletieren Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 300-400 x g und 4 °C. Saugen Sie den Überstand vollständig ab; verbleibender Überstand verdünnt den Lysepuffer und verlangsamt die Reaktion.
3. Resuspendieren Sie in ACK. Geben Sie 1-3 mL ACK-Lysepuffer 1X pro Milz zu. Die Anweisung von Lonza gibt die allgemeine Regel für jedes Pellet an: ein Volumen ACK zugeben, das dem Pelletvolumen entspricht. Resuspendieren Sie vorsichtig und vollständig — Klumpen lysieren ungleichmäßig.
4. Inkubieren Sie. 1-5 Minuten bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Mischen. Das Protokoll von Lonza sieht vor, das Röhrchen 30-60 Sekunden zu schwenken. Viele Labore beobachten die Suspension und brechen ab, sobald sie von undurchsichtig rot in klar durchscheinend rot umschlägt, was typischerweise 1-2 Minuten dauert. Überschreiten Sie 5 Minuten nicht.
5. Stoppen Sie die Reaktion durch Verdünnung. Füllen Sie das Röhrchen sofort auf mindestens 10 Volumina mit PBS oder serumfreiem Medium auf. Was ACK stoppt, ist die Verdünnung, nicht eine Neutralisation.
6. Waschen Sie. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 300 x g und verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet sollte nun weiß oder blassrosa sein.
7. Wiederholen Sie bei Bedarf. Ist das Pellet noch sichtbar rot, wiederholen Sie die Schritte 3-6 einmal. Ein zweiter Durchgang ist bei Milz normal; ein dritter deutet darauf hin, dass zuvor etwas schiefgelaufen ist — meist unvollständiges Resuspendieren oder kalter Puffer.
8. Filtrieren und zählen. Führen Sie die Suspension durch ein 40-70 µm Zellsieb, um Zelltrümmer und Aggregate lysierter Zellen zu entfernen, zählen Sie dann mit Trypanblau und fahren Sie fort.

Knochenmark folgt demselben Protokoll mit kürzerer Inkubation, typischerweise 30-90 Sekunden, weil die Erythrozytenlast geringer ist.

Buffy Coat und verdünntes Blut benötigen mehr Puffer im Verhältnis zur Probe und eine längere Inkubation, in der Regel 5-10 Minuten bei Raumtemperatur mit 10-20 Volumina ACK pro Volumen Zellpellet. Die Hersteller sind sich bei Vollblut uneinig: Gibco führt EDTA-behandeltes Vollblut unter den vorgesehenen Probenarten auf, während Lonza in der Gebrauchsanweisung ausdrücklich angibt, dass das Produkt nicht zur Lyse von Vollblut zu verwenden ist. Richten Sie sich nach der Anweisung, die dem tatsächlich gekauften Material beiliegt.

Unvollständige Lyse — das Pellet bleibt rot. Ursachen, nach Häufigkeit geordnet: Puffer kalt oder direkt aus dem Kühlschrank verwendet (zuerst auf Raumtemperatur bringen); Pellet nicht vollständig resuspendiert, sodass Klumpen zurückbleiben, die der Puffer nicht erreicht; zu wenig Puffer für die Erythrozytenlast; zu viel verbliebener Überstand, der den Puffer verdünnt; abgelaufener oder mehrfach eingefrorener Puffer. Verbliebene Erythrozyten sind nicht nur ein optisches Problem — sie verstopfen die Fluidik von Durchflusszytometern, verfälschen automatische Zählungen und bringen zusätzliche Zelltrümmer in nachfolgende Präparationen.

Überlyse — die Viabilität sinkt und die Ausbeute fällt. Der mit Abstand häufigste Protokollfehler besteht darin, Zellen zu lange in ACK zu belassen. Jenseits von etwa fünf Minuten beginnen Leukozyten anzuschwellen und zu sterben, Granulozyten sind zuerst betroffen, und Oberflächenepitope können so weit verloren gehen oder verändert werden, dass die durchflusszytometrische Färbung leidet. Liegt Ihre Viabilität nach der Lyse bei einer frischen Milzpräparation unter 85-90% und war die Gewebeaufarbeitung sauber, ist der Lyseschritt der erste Ort, an dem Sie suchen sollten.

Zellen verklumpen nach der Lyse. Freie DNA aus lysierten Zellen ist die übliche Ursache. Die Zugabe von DNase I zum Waschschritt oder EDTA im Waschpuffer behebt das in der Regel. Ein Filtrieren über ein 40 µm Zellsieb unmittelbar nach dem letzten Waschschritt entfernt die bereits gebildeten Aggregate.

Nachgelagerte enzymatische Reaktionen funktionieren nicht. Aus dem Lysepuffer verschlepptes EDTA komplexiert Calcium und Magnesium und hemmt jedes anschließend verwendete Enzym, das auf zweiwertige Kationen angewiesen ist — Restriktionsenzyme, Polymerasen in manchen Puffersystemen und insbesondere Kollagenase oder Dispase. Waschen Sie vor jedem enzymatischen Schritt zweimal in einem Puffer mit zweiwertigen Kationen, und führen Sie ACK-behandelte Zellen niemals direkt in einen Dispase- oder Kollagenase-Verdau über.

Funktionelle Assays verhalten sich merkwürdig. Die oben beschriebene vorübergehende intrazelluläre Alkalisierung kann den Aktivierungszustand, die Calciumregulation und Messungen des respiratorischen Bursts verändern. Wenn eine funktionelle Messgröße nicht zum durchflusszytometrischen Phänotyp passt, vergleichen Sie mit über einen Dichtegradienten getrennten Zellen desselben Spenders, bevor Sie biologische Schlüsse ziehen.

Kontamination tritt Tage später auf. ACK ist eine einfache wässrige Lösung ohne antimikrobielle Wirkung und ohne Konservierungsmittel. Selbst angesetzt aus unfiltriertem Wasser oder wiederholt aus einer gemeinsam genutzten Flasche abgegossen, ist es ein bequemer Träger für Kontaminationen in eine ansonsten saubere Präparation. Filtrieren Sie über 0.22 µm, aliquotieren Sie und behandeln Sie den Puffer mit derselben Sorgfalt wie ein Medium.

Ammoniumchlorid reizt Haut, Augen und Atemwege und ist gesundheitsschädlich beim Verschlucken. In den hier verwendeten Konzentrationen ist die Lösung mild, der Feststoff jedoch nicht, und beim Einwiegen entsteht Staub. Wiegen Sie im Abzug oder mit örtlicher Absaugung ein, tragen Sie Augenschutz und vermeiden Sie das Einatmen des Pulvers.

Mischen Sie Ammoniumchloridlösungen nicht mit hypochlorithaltigen Bleichmitteln. Das ist die einzige wirklich ernste Gefahr bei einem ansonsten harmlosen Reagenz. Ammoniumsalze reagieren mit Hypochlorit zu Chloramingas, das beim Einatmen giftig ist. Labore, die Absaugbehälter mit Bleichmittel dekontaminieren, müssen wissen, dass ACK-Abfall in einer Bleichmittelfalle ein reales Chloraminrisiko darstellt. Entsorgen Sie Ammoniumchloridabfall getrennt oder verdünnen Sie ihn stark mit Wasser, bevor er auf Hypochlorit trifft.

Kontakt mit starken Basen setzt aus demselben Grund Ammoniakgas frei.

Endotoxin ist für die Immunologie entscheidend. ACK wird fast ausschließlich an Immunzellen eingesetzt — also an den Zellen, die am empfindlichsten auf eine Kontamination mit Lipopolysaccharid reagieren. Ein Puffer, der aus deionisiertem Laborwasser mit unbekanntem Endotoxingehalt angesetzt wurde, kann genau die Zellen vorprägen oder aktivieren, die Sie phänotypisieren wollen, und der Effekt sieht wie Biologie aus. Verwenden Sie Wasser in Zellkulturqualität mit angegebener Endotoxinspezifikation und für funktionelle Immunologie einen kommerziellen Puffer mit dokumentiertem Endotoxingrenzwert.

Lagerung und Stabilität. Einmal angesetzt und filtriert, ist ACK gekühlt und vor Licht geschützt über Monate stabil. Kommerzieller 1X-Puffer trägt typischerweise eine Haltbarkeit von 12 Monaten. Nicht wiederholt einfrieren und auftauen. Verwerfen Sie jede Flasche, die trüb wird oder Partikel bildet.

ACK ist nicht der einzige Weg, Erythrozyten loszuwerden, und nicht immer der beste.

Hypotone Lyse mit Wasser beruht auf demselben osmotischen Prinzip, allerdings grob: kurze Einwirkung von destilliertem Wasser, gefolgt von der Wiederherstellung der Tonizität mit konzentrierter Kochsalzlösung. Sie ist günstig und braucht außer Wasser und 10X PBS keine Reagenzien, doch das Fenster zwischen der Lyse der Erythrozyten und der Schädigung der Leukozyten ist deutlich enger als bei ACK, und die Reproduzierbarkeit zwischen Anwendern ist schlecht. Sie hält sich vor allem als Notlösung.

Dichtegradiententrennung (Ficoll-Paque, Percoll, Lymphoprep) entfernt Erythrozyten und Granulozyten gemeinsam über die Schwebedichte, statt irgendetwas zu lysieren. Sie ist schonender, setzt Leukozyten weder Ammonium noch intrazellulären pH-Verschiebungen aus und ist die richtige Wahl für funktionelle Assays. Die Nachteile sind Zeitaufwand, Kosten pro Probe, der Verlust der Granulozyten, falls Sie diese benötigen, und eine Technik, die im größeren Maßstab schwerer reproduzierbar zu betreiben ist.

Kommerzielle Reagenzien zum gleichzeitigen Lysieren und Fixieren, wie sie in der klinischen Durchflusszytometrie eingesetzt werden, lysieren Erythrozyten und fixieren Leukozyten in einem Schritt. Sie sind hervorragend für die Immunphänotypisierung von Vollblut und unbrauchbar, wenn Sie anschließend lebende Zellen benötigen.

Gar keine Lyse ist eine legitime Option, wenn die nachgelagerte Methode Erythrozyten toleriert — manche Isolierungen mit magnetischen Beads etwa stört das nicht.

Für die Aufgabe, für die ACK gebaut wurde — die Gewinnung vitaler Splenozyten oder Knochenmarkzellen der Maus für Kultur, Sortierung oder adoptiven Transfer —, bleibt ACK der Standard, weil es schnell, günstig, hinreichend schonend und bei eingehaltenem Timing reproduzierbar ist.