Kontamination in der Zellkultur

Es lohnt sich, die Kontamination in der Zellkultur in zwei Gruppen zu unterteilen, denn beide erfordern ein völlig unterschiedliches Vorgehen im Labor.

Die sichtbare Gruppe — Bakterien, Hefen und Fadenpilze — wächst schnell, verändert das Medium und ist innerhalb von einem bis fünf Tagen offensichtlich. Diese finden Sie durch bloßes Hinsehen. Sie sind ärgerlich, machen sich aber selbst bemerkbar, und die nützliche Frage lautet nicht „was ist es", sondern „wie ist es hineingelangt" — denn die Antwort ist fast immer ein konkreter, behebbarer Fehler in der aseptischen Arbeitstechnik.

Die unsichtbare Gruppe — Mykoplasmen, virale Kontamination und Kreuzkontamination mit einer falsch identifizierten Zelllinie — erzeugt keine Trübung, keinen Farbumschlag und nichts, was Sie sehen könnten. Sie wird nur durch gezielte Testung gefunden und schadet Ihren Ergebnissen gerade deshalb weit mehr, weil sie stumm bleibt. Eine falsch identifizierte oder mykoplasmenpositive Linie liefert weiterhin sauber aussehende, reproduzierbare Daten — nur über den falschen Gegenstand.

Es gibt eine siebte Kategorie, die eine eigene Benennung verdient: chemische Kontamination — Endotoxin, Detergenzienrückstände, aus Schläuchen ausgelaugte Weichmacher, Metallionen oder ein Medienbestandteil außerhalb der Spezifikation. Sie ist kein Organismus, sie ist unsichtbar, und sie erzeugt genau die Symptome, die man am häufigsten damit erklärt, „den Zellen gehe es nicht gut": langsames Wachstum, schlechte Anheftung, ausbleibende Konfluenz.

Aussehen. Das Medium wird trüb, meist innerhalb von 24–72 Stunden nach dem auslösenden Ereignis. Enthält das Medium Phenolrot, senkt eine starke aerobe oder fakultative Population den pH-Wert und färbt das Medium von Rot-Orange nach Gelb um. Im Phasenkontrast bei 200–400× erscheinen Bakterien als sehr kleine Stäbchen, Kokken oder Kokkobazillen, typischerweise 0.5–1 µm im Durchmesser und bis etwa 20 µm lang, die sich mit deutlicher Brownscher oder — bei beweglichen Arten — gerichteter Bewegung zwischen den Zellen bewegen. Ein flimmernder, körniger Hintergrund zwischen adhärenten Zellen, der gestern noch nicht da war, ist das klassische erste Anzeichen.

Häufige Quellen. Die Arbeitstechnik des Anwenders — Hände, Ärmel, Sprechen über offenen Gefäßen, das Führen eines unsterilen Gegenstands über einen offenen Kulturkolben. Kontaminierte Wasserbäder und Wasserschalen im Inkubator. Nicht oder falsch filtrierte Zusätze. Eine kontaminierte Vorratsflasche, die für mehrere Linien verwendet wird.

Maßnahme. Verwerfen. Das Gefäß autoklavieren oder desinfizieren, bevor es die Sicherheitswerkbank verlässt. Versuchen Sie nicht, einen bakteriell kontaminierten Kolben mit Antibiotika zu retten: Selbst wenn das sichtbare Wachstum unterdrückt wird, bleiben Überlebende in geringer Zahl und ihre Endotoxinlast bestehen — Sie haben ein offensichtliches Problem lediglich in ein verborgenes verwandelt.

Aussehen. Hefen erscheinen unter dem Mikroskop als einzelne ovale oder kugelige Partikel, typischerweise 3–5 µm groß und damit deutlich größer als Bakterien, häufig sichtbar sprossend — eine kleinere Tochterzelle sitzt einer größeren Mutterzelle an. Die Sprossung ist das mit Abstand nützlichste Erkennungsmerkmal.

Das Medium trübt sich, meist jedoch langsamer als bei Bakterien und oft erst, wenn die Kontamination bereits weit fortgeschritten ist. Das pH-Verhalten ist charakteristisch und sollte bekannt sein: Hefen verursachen bis zu einer starken Kontamination kaum eine pH-Änderung, danach steigt der pH-Wert typischerweise an, statt zu fallen. Eine trübe Kultur, deren Phenolrot eher rosa-violett als gelb geworden ist, spricht eher für Hefen als für Bakterien.

Häufige Quellen. Luftgetragen — Hefen sind in der Umgebung allgegenwärtig, sodass eine Sicherheitswerkbank mit gestörter Luftströmung, ein schlecht gewarteter HEPA-Filter oder Arbeiten außerhalb der Werkbank die übliche Erklärung sind. Haut und Haare. Kontaminierte Wasserbäder.

Maßnahme. Verwerfen. Anschließend die Werkbank prüfen: die Luftströmung zertifizieren lassen, den Filter kontrollieren und sicherstellen, dass niemand mit falscher Frontscheibenhöhe arbeitet.

Aussehen. Fadenpilze sind der optisch auffälligste aller Kontaminanten. Unter dem Mikroskop erscheinen Myzelien als dünne, schleierartig verzweigte Fäden (Hyphen), die das Gesichtsfeld durchziehen, mitunter mit dichteren Sporenhaufen. Mit bloßem Auge beginnt die Kontamination als kleine weiße, gelbe, graue oder schwarze flaumige Punkte, die entweder im Medium schweben oder an der Kolbenwand an der Flüssigkeitsoberfläche haften, und entwickelt sich innerhalb weniger Tage zu großen pelzigen Flecken. Das Medium bleibt oft länger klar als bei Bakterien, und der pH-Wert kann im Verlauf leicht ansteigen.

Das „fädige" oder „wattige" Erscheinungsbild, das Anwender in einem Kolben beschreiben, ist fast immer ein Fadenpilz.

Häufige Quellen. Luftgetragene Sporen — Pilzsporen sind widerstandsfähig, allgegenwärtig und überdauern lange auf Oberflächen. Bauarbeiten, Feuchtigkeit, schlecht gewartete Inkubatoren (die Wasserschale ist ein klassisches Reservoir) und kontaminierte Inkubatoreinschübe. Kartonverpackungen, die in den Kulturraum gebracht werden, sind eine unterschätzte Quelle.

Maßnahme. Verwerfen — und den Vorfall als Ereignis auf Inkubatorebene behandeln, nicht auf Kolbenebene. Den Inkubator leeren, Einschübe und Wasserschale entnehmen und autoklavieren, den Dekontaminationszyklus des Inkubators laufen lassen oder mit einem zugelassenen sporiziden Mittel auswischen und die Wasserschale mit frischem sterilem Wasser samt zugelassenem pilzhemmendem Wasserzusatz neu befüllen. Pilzsporen, die einen Inkubator besiedelt haben, infizieren neue Kulturen so lange immer wieder, bis der Inkubator selbst gereinigt ist.

Aussehen. Keines. Genau darin besteht das Problem. Mykoplasmen erreichen 10⁷–10⁸ Organismen pro mL ohne Trübung, ohne sichtbare pH-Änderung und ohne irgendein Anzeichen unter einem routinemäßig genutzten Inversmikroskop. Mit 0.3–0.8 µm und ohne Zellwand passieren sie 0.2-µm-Filter und sind gegenüber Penicillin von Natur aus resistent.

Indirekte Hinweise sind unspezifisch und leicht wegzuerklären: allmählich langsameres Wachstum, geringere Sättigungsdichte, schnellere Erschöpfung des Mediums als erwartet, sinkende Transfektionseffizienz, eine driftende Wirkstoffantwort. Jedes dieser Anzeichen sollte einen Test auslösen und nicht einen Wechsel der Serumcharge.

Häufige Quellen. Andere kontaminierte Kulturen im selben Labor, verbreitet über Aerosole und gemeinsam genutzte Flaschen; das Laborpersonal, da mehrere kontaminierende Arten Kommensalen der menschlichen Mundhöhle sind; Serum und Trypsin tierischen Ursprungs, historisch bedeutsam und heute deutlich zurückgedrängt; sowie eingehende Zelllinien aus Quellen außerhalb anerkannter Zellbanken.

Maßnahme. Mit einer zweiten Methode bestätigen, in Quarantäne nehmen und in der Regel verwerfen — der Neustart aus einem sauberen kryokonservierten Stock ist schneller und besser vertretbar als eine Behandlung. Der vollständige Vergleich der Nachweismethoden, die Testhäufigkeit und die Entscheidung zwischen Eliminierung und Verwerfen sind in der Referenz zur Mykoplasmentestung beschrieben.

Aussehen. In der betroffenen Kultur meist keines. Viele Viren vermehren sich in einer Wirtszelllinie ohne zytopathischen Effekt, sodass die Kultur normal aussieht und normal wächst. Tritt ein zytopathischer Effekt auf, zeigt er sich als Abrundung, Ablösung, Synzytienbildung oder plaqueartige Aufhellungen im Zellrasen, die leicht mit Überkonfluenz oder einer misslungenen Trypsinierung verwechselt werden.

Warum das zählt. Für routinemäßige Forschungskulturen ist eine virale Kontamination selten ein Problem, für jedes Material zur Herstellung von Biologika oder Zelltherapeutika jedoch ein gravierendes — und sie ist ein Aspekt der biologischen Sicherheit im Labor, wenn das Ausgangsmaterial menschlichen Ursprungs ist oder von Primaten stammt.

Häufige Quellen. Das ursprüngliche Gewebe oder Spendermaterial; Rohstoffe tierischen Ursprungs, vor allem Serum und Trypsin; sowie andere Kulturen in derselben Einrichtung.

Maßnahme. Die Virustestung ist Spezialistenarbeit — PCR-Panels für bestimmte Erreger und In-vitro-Prüfungen auf Fremdagenzien an Indikatorzelllinien für eine breit angelegte Untersuchung. Für die Routineforschung ist die Vorbeugung die praktikable Kontrolle: Serum und Trypsin von Lieferanten beziehen, die Daten zur Virusprüfung veröffentlichen, oder Reagenzien frei von tierischen Bestandteilen (ADCF) und rekombinante Dissoziationsenzyme verwenden, die diesen Weg vollständig ausschließen.

Die folgenreichste Kontamination in der Zellbiologie ist überhaupt kein Organismus: Es ist eine Zelllinie, die eine andere überwächst, oder eine, die irgendwann in ihrer Geschichte falsch beschriftet wurde.

Groß angelegte Authentifizierungsstudien haben wiederholt gezeigt, dass eine erhebliche Minderheit der im Laboralltag verwendeten Zelllinien nicht das ist, was ihre Beschriftung angibt. HeLa ist der bekannteste Übeltäter — schnellwachsend, robust und historisch für die Verdrängung vieler anderer Linien verantwortlich —, aber jede vitale Linie überwächst eine langsamere, sobald beide je vermischt werden.

Aussehen. Keines, oder eine langsame Drift in Morphologie, Wachstumsrate oder Markerexpression, die man leicht der Passagenzahl zuschreibt.

Quellen. Zwei Linien gleichzeitig in der Werkbank bearbeiten. Gemeinsam genutzte Medienflaschen. Falsch beschriftete Kryoröhrchen. Mangelhafte Dokumentation im Gefrierlager. Der Erhalt einer Linie von einer Kooperationsgruppe, deren eigene Herkunftskette unbekannt ist.

Maßnahme und Vorbeugung. Die STR-Analyse (Short Tandem Repeat) ist die Standardmethode zur Authentifizierung humaner Linien; für murine Linien existieren Maus-STR-Panels. Erstellen Sie ein Profil, wenn Sie eine Linie erhalten, wenn Sie sie banken, und danach in regelmäßigen Abständen. Haben Sie niemals zwei Zelllinien gleichzeitig in der Werkbank geöffnet. Teilen Sie niemals eine Medienflasche zwischen zwei Linien. Die meisten Fachzeitschriften verlangen inzwischen eine STR-geprüfte Identitätserklärung, und die Kosten einer Analyse sind verschwindend gering gegenüber den Kosten eines wiederholten Experiments.

Nicht alles, was falsch aussieht, lebt. Bevor Sie eine Kultur verwerfen, schließen Sie die nicht-biologischen Erklärungen aus:

• Endotoxin aus Wasser, Serum oder Rohstoffen aktiviert immunkompetente Zellen und verändert Wachstum und Differenzierung ohne jedes sichtbare Anzeichen. Es ist hitzestabil, übersteht das Autoklavieren und wird durch eine Filtration mit 0.2 µm nicht entfernt.
• Detergenzien- oder Desinfektionsmittelrückstände an Glasgeräten oder von einer unzureichend nachgespülten Arbeitsfläche der Werkbank.
• Auslaugung von Weichmachern oder extrahierbaren Stoffen aus Schläuchen, Vorratsflaschen oder Kunststoffen, die nicht zellkulturtauglich sind.
• Präzipitate — Calciumphosphatkristalle, ausgefallenes Serumprotein oder nach Kühllagerung auskristallisierte Medienbestandteile — sehen unter dem Mikroskop wie partikuläre Kontamination aus, sind aber lichtbrechend und geometrisch, bewegen sich nicht aus eigener Kraft und vermehren sich zwischen zwei Beobachtungen nicht. Betrachten Sie sie nach vier Stunden erneut: Kontamination wächst, ein Präzipitat nicht.
• Zelltrümmer und apoptotische Körperchen aus einer gestressten oder überkonfluenten Kultur können bei geringer Vergrößerung einer bakteriellen Kontamination ähneln. Eine höhere Vergrößerung klärt das meist.

Grob danach geordnet, wie viel Kontamination jede Maßnahme je Aufwandseinheit verhindert:

1. Aseptische Arbeitstechnik und Disziplin an der Werkbank. Auf der richtigen Frontscheibenhöhe arbeiten, Hände und Materialien stromabwärts kritischer Öffnungen halten, niemals etwas über ein offenes Gefäß führen, jeden Gegenstand beim Einbringen in die Werkbank mit 70% Ethanol abwischen und nicht in die Sicherheitswerkbank hineinsprechen. Dieser eine Punkt verhindert den Großteil aller Kontaminationen.
2. Immer nur eine Linie geöffnet, eine Flasche je Linie. Beseitigt Kreuzkontamination und die meiste horizontale mikrobielle Ausbreitung in einem Zug.
3. Eingehende Kulturen in Quarantäne in einem separaten Inkubator halten, bis sie getestet sind.
4. Den Inkubator warten. Wöchentlicher Wechsel der Wasserschale mit einem zugelassenen Zusatz, monatliches Auswischen, planmäßiger Dekontaminationszyklus und HEPA-Filterwechsel im vom Hersteller vorgegebenen Intervall.
5. Die Werkbank jährlich zertifizieren lassen und prüfen, ob der Luftströmungsalarm funktioniert.
6. Früh banken, sauber banken und die Bank testen. Eine geprüfte Masterbank mit niedriger Passagenzahl macht aus einem Kontaminationsereignis eine Unannehmlichkeit von einem Nachmittag.
7. Prophylaktische Antibiotika nicht als Ersatz für all das verwenden. Sie verbergen eine bakterielle Kontamination auf niedrigem Niveau, richten gegen Mykoplasmen, Pilze oder Kreuzkontamination nichts aus und führen dazu, dass Labore nicht mehr bemerken, wenn ihre Arbeitstechnik nachgelassen hat.