EMEM vs. DMEM: Was die Modifikation tatsächlich verändert hat

Ein großer Teil der Verwirrung hinter dieser Frage ist Nomenklatur und nicht Chemie.

EMEM steht für Eagle's Minimum Essential Medium. MEM steht für Minimum Essential Medium. Beide bezeichnen dieselbe Formulierung — jene, die Harry Eagle 1959 veröffentlichte. ATCC bezeichnet seine Version als EMEM; Gibco, Sigma und die meisten anderen Anbieter bezeichnen ihre als MEM. Ein Protokoll, das EMEM verlangt, meint MEM, und umgekehrt.

Nicht identisch ist dagegen die Flasche. Die Anbieter modifizieren die Basisformulierung, und die Unterschiede sind real:

• Gibco MEM (11095) enthält Earle-Salze mit 2.2 g/L Natriumbicarbonat, 1.0 g/L Glucose und 2 mM L-Glutamin, ohne nicht-essenzielle Aminosäuren und ohne Natriumpyruvat.
• ATCC EMEM (30-2003) enthält Earle-Salze mit nur 1500 mg/L Natriumbicarbonat und zusätzlich nicht-essenzielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat. Die Spezifikation lautet pH 7.0-7.4 und Osmolalität 260-320 mOsm/kg.

Ein ATCC EMEM enthält also bereits die nicht-essenziellen Aminosäuren, die Anwender eines Gibco MEM aus einem 100X-Zusatz ergänzen müssen, und es führt ein Drittel weniger Natriumbicarbonat. Wenn Sie den Anbieter wechseln und sich Ihre Kulturen plötzlich anders verhalten, sollten Sie zuerst hier nachsehen. Lesen Sie stets die Modifikationszeile auf dem Etikett, statt den vier Buchstaben zu vertrauen.

Harry Eagle bestimmte den Mindestsatz an Nährstoffen, den kultivierte Säugerzellen nicht selbst herstellen können. Basal Medium Eagle kam 1955 zuerst; Minimum Essential Medium folgte 1959 mit einem überarbeiteten und etwas reicheren Aminosäurenspektrum. Die Entwurfsidee steckt im Namen — das Minimum, das funktioniert, nicht das Maximum, das hilft.

Renato Dulbecco und Gordon Freeman modifizierten Eagles Medium 1959 zu einem bestimmten Zweck: um Mausembryo-Fibroblasten für Plaque-Assays mit dem Polyomavirus zu kultivieren. Diese Anwendung verlangte kräftig wachsende Zellen, also reicherte die Modifikation nahezu alles an. Das Ergebnis war Dulbecco's Modified Eagle Medium.

Diese Vorgeschichte erklärt den Charakter der beiden Medien. EMEM ist mager und war als definiertes Minimum gedacht. DMEM ist reich und wurde entworfen, um die Proliferation anzutreiben. Keines ist besser; sie wurden nach verschiedenen Vorgaben gebaut, und das richtige hängt davon ab, welches Verhalten Ihre Zellen zeigen sollen.

Die verbreitete Behauptung, DMEM enthalte die vierfache Menge an Aminosäuren wie MEM, ist falsch, und es kommt darauf an, das richtig zu haben, wenn man über Nährstofflimitierung nachdenkt. Die Gibco-Formulierungen Komponente für Komponente verglichen:

Vitamine: vierfach, nahezu exakt. Cholinchlorid, D-Calciumpantothenat, Folsäure, Niacinamid und Thiaminhydrochlorid steigen sämtlich von 1 mg/L in MEM auf 4 mg/L in DMEM. Riboflavin steigt von 0.1 auf 0.4 mg/L, i-Inositol von 2 auf 7.2 mg/L. Hinzu kommt ein Austausch statt einer Erhöhung: MEM verwendet Pyridoxalhydrochlorid, DMEM verwendet Pyridoxinhydrochlorid.

Aminosäuren: etwa doppelt, mit Ausnahmen. Leucin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tyrosin, Valin und Cystin sind allesamt annähernd verdoppelt — Leucin steigt von 52 auf 105 mg/L, Methionin von 15 auf 30. Arginin sinkt dagegen von 126 mg/L in MEM auf 84 in DMEM. Histidin ist mit 42 mg/L in beiden identisch. Tryptophan steigt lediglich von 10 auf 16 mg/L.

L-Glutamin: verdoppelt, von 292 mg/L (2 mM) auf 584 mg/L (4 mM).

Glycin und Serin: neu hinzugefügt. MEM enthält keines von beiden; DMEM enthält beide mit je 0.4 mM. Das sind die einzigen zwei nicht-essenziellen Aminosäuren in DMEM — die übrigen fünf des Standard-NEAA-Satzes fehlen.

Glucose: unverändert oder vervierfacht, je nach Version. MEM enthält 1.0 g/L. DMEM mit niedriger Glucose enthält ebenfalls 1.0 g/L; DMEM mit hoher Glucose enthält 4.5 g/L (25 mM).

Natriumbicarbonat: deutlich erhöht, von 2.2 g/L (26.2 mM) in Gibco MEM auf 3.7 g/L (44.0 mM) in DMEM. Natriumchlorid ist entsprechend gesenkt, von 6.8 auf 6.4 g/L, damit die Osmolalität im Zielbereich bleibt.

Eisen(III)-nitrat neu zugesetzt mit 0.1 mg/L, eine Eisenquelle, die MEM völlig fehlt.

Phenolrot erhöht von 10 auf 15 mg/L — deshalb wirkt DMEM bei gleichem pH-Wert schlicht röter als MEM.

Die Salzbasis ist ansonsten gemeinsam: Beide führen Calciumchlorid mit 1.8 mM, Magnesiumsulfat mit 0.81 mM und Kaliumchlorid mit 5.33 mM.

MEM wird auf zwei verschiedenen Salzbasen verkauft, und das führt häufiger in die Irre als die Aminosäurenunterschiede.

MEM mit Earle-Salzen ist die Standardversion. Ihre Salzkomponente ist genau die Earle's Balanced Salt Solution — 2.2 g/L Natriumbicarbonat, 6.8 g/L Natriumchlorid, 0.4 g/L Kaliumchlorid, 140 mg/L Natriumdihydrogenphosphat und 1.0 g/L Glucose, dazu Calcium und Magnesium. Sie ist für einen CO2-Inkubator ausgelegt, üblicherweise mit 5 %.

MEM mit Hanks-Salzen setzt stattdessen die Hanks' Balanced Salt Solution ein, deren Natriumbicarbonatgehalt nur 0.35 g/L beträgt. Diese Formulierung ist darauf ausgelegt, den pH-Wert an Umgebungsluft in einem verschlossenen Gefäß ohne CO2-Inkubator zu halten.

DMEM wird ausschließlich auf einer von Earle abgeleiteten Basis hergestellt, und zwar auf einer modifizierten — mehr Natriumbicarbonat, etwas weniger Natriumchlorid und Phosphat, dazu das Eisen(III)-nitrat. Ein DMEM mit Hanks-Salzen gibt es nicht, weil 3.7 g/L Natriumbicarbonat und Umgebungsluft von der Auslegung her unvereinbar sind.

Die Regel, die all das verbindet, lautet: Das Natriumbicarbonat muss zur Atmosphäre passen. Die Anbieter geben grob an: unter 1.5 g/L für Umgebungsluft oder 4 % CO2, 1.5-2.2 g/L für 5 %, 2.2-3.4 g/L für 7 % und über 3.5 g/L für 10 %. Gibco DMEM mit 3.7 g/L ist für 10 % CO2 formuliert. Die meisten Labore betreiben es trotzdem bei 5 %, und es funktioniert, doch liegt das Medium dann über seinem Auslegungs-pH — deshalb kann eine Flasche DMEM schon am Tag des Öffnens rosa aussehen. ATCC EMEM mit 1.5 g/L ist ausdrücklich für 5 % CO2 in Luft spezifiziert, und ATCC weist darauf hin, dass bei höherem CO2 mehr Natriumbicarbonat nötig sein kann.

Wenn Sie eine Zelllinie zwischen EMEM und DMEM umsetzen, ohne an den Inkubator zu denken, kann allein die pH-Verschiebung die beobachtete Wachstumsänderung erklären.

Beginnen Sie mit der Empfehlung der Zellbank. ATCC, ECACC, DSMZ und JCRB geben für jede hinterlegte Linie ein bestimmtes Medium an, und diese Empfehlungen spiegeln die Bedingungen wider, unter denen die Linie charakterisiert wurde. Davon abzuweichen ist legitim, verändert aber Wachstumsrate, Morphologie und oft den Phänotyp und erschwert den Vergleich Ihrer Daten mit veröffentlichten Arbeiten an derselben Linie.

EMEM/MEM passt zu langsamer wachsenden adhärenten Zellen mit mäßigem Stoffwechselbedarf: diploide Fibroblastenstämme wie MRC-5 und WI-38, viele Primärzellen, Vero-Zellen und einen großen Teil der klassischen Virologie, in der MEM seit Jahrzehnten das Standardmedium für Wirtszellen ist. ATCC empfiehlt EMEM für eine große Zahl adhärenter Linien einschließlich HeLa. Seine magerere Zusammensetzung ist dort ein Vorteil, wo Zellen stetig statt so schnell wie möglich wachsen sollen und wo ein definierter Mindesthintergrund für den Assay wichtig ist.

DMEM passt zu rasch proliferierenden, stoffwechselaktiven Linien: HEK293 und seinen Derivaten, NIH/3T3, COS, vielen transformierten und transfizierten Linien sowie den meisten Arbeiten zur transienten Transfektion und Virusproduktion. Das zusätzliche L-Glutamin, die Vitamine und — in der Version mit hoher Glucose — der Kohlenstoff sind genau das, was diese Zellen verbrauchen.

DMEM mit hoher oder niedriger Glucose ist eine eigene Entscheidung. Hohe Glucose (4.5 g/L) trägt Wachstum bei hoher Dichte, Transfektion und Virusproduktion und ist der Standard für Hybridome. Niedrige Glucose (1.0 g/L) wird für primäre Hepatozyten bevorzugt, für Zellen, deren Stoffwechsel untersucht wird, und überall dort, wo Lactatanhäufung und rasche Ansäuerung ein Problem sind. Beachten Sie: DMEM mit niedriger Glucose führt weiterhin 3.7 g/L Natriumbicarbonat — die Glucose zu senken ändert den CO2-Bedarf nicht.

MEM alpha ist als dritte Option wissenswert. Es ist eine weitergehende Modifikation von MEM mit zusätzlichen Aminosäuren einschließlich des nicht-essenziellen Satzes, zusätzlichen Vitaminen, Natriumpyruvat und Liponsäure und wird mit oder ohne Nukleoside und Desoxyribonukleoside verkauft. Es ist die Standardwahl für mesenchymale Stromazellen und für viele hämatopoetische Arbeiten und steht im Nährstoffreichtum DMEM näher als schlichtem MEM.

DMEM eins zu eins durch EMEM zu ersetzen ist der häufige Fehler, und die Folgen sind vorhersehbar und nicht rätselhaft.

Der Wechsel von EMEM zu DMEM mit hoher Glucose hebt die Glucose um das 4.5-Fache, das L-Glutamin um das Doppelte und die Vitamine um das Vierfache — alles auf einmal. Die Zellen reagieren mit schnellerem Wachstum und deutlich mehr Lactat, das Medium säuert also früher an und muss häufiger gewechselt werden. Wachstumskurven, Verdopplungszeiten, Aussaatdichten und jeder daraus abgeleitete Zeitplan verschieben sich. Bleibt der Inkubator bei 5 % CO2, hebt das höhere Natriumbicarbonat außerdem den Start-pH über den bisherigen Wert.

In der Gegenrichtung, von DMEM zu EMEM, können Zellen, die sich auf den reicheren Hintergrund verlassen haben, langsamer werden oder stehenbleiben — und wenn Sie zu einem Gibco MEM statt zu einem ATCC EMEM wechseln, haben Sie zugleich unbeabsichtigt die nicht-essenziellen Aminosäuren und das Pyruvat entfernt.

Drei Regeln machen den Übergang sicher. Passen Sie schrittweise an, über zwei oder drei Passagen, mit Mischungen als Zwischenstufen statt mit einem einzigen harten Wechsel. Wechseln Sie das Medium nie mitten in einem Experiment oder zwischen einem Experiment und seiner Kontrolle. Und erheben Sie die Wachstumskurve nach der Anpassung neu, denn jede nachgelagerte Zahl — Aussaatdichte, Fütterungsintervall, Erntetag — wurde aus dem alten Medium abgeleitet.

Wenn Sie vom MEM eines Anbieters zu einer Formulierung ohne nicht-essenzielle Aminosäuren wechseln, ergänzen Sie diese wieder mit 1X aus einem 100X-Zusatz, was 0.1 mM von jeder der sieben ergibt. Diese eine Zugabe erklärt einen großen Teil des scheinbaren Unterschieds zwischen einem ATCC EMEM und einem schlichten MEM.