HEPES-Puffer in der Zellkultur

HEPES ist 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure, CAS 7365-45-9, Molekulargewicht 238.30 g/mol für die freie Säure. Es gehört zur Familie der zwitterionischen Puffer, die Norman Good und Kollegen in den 1960er-Jahren beschrieben haben und die eigens für biologische Arbeiten nach einer Kriterienliste ausgewählt wurden: ein pKa im physiologischen Bereich, hohe Wasserlöslichkeit, minimale Permeabilität durch Zellmembranen, geringe Absorption im sichtbaren und nahen UV-Bereich, chemische Stabilität und eine geringe Neigung zur Komplexbildung mit Metallionen.

Diese Auswahlkriterien sind der Grund, warum HEPES älteren organischen Puffern vorgezogen wird. Ein Puffer, der die Plasmamembran frei durchquert, würde neben dem Medium auch das Zytoplasma puffern und den intrazellulären pH-Wert stören. Ein Puffer, der Calcium, Magnesium, Zink oder Eisen chelatiert, würde der Formulierung Spurenmetalle entziehen und das Zellverhalten so verändern, dass es wie ein biologisches Ergebnis aussieht. HEPES vermeidet beide Probleme recht gut, weshalb es zum Standardzusatzpuffer für die Säugerzellkultur geworden ist.

HEPES wird in zwei chemisch verschiedenen Formen verkauft, und der Unterschied ist bei der Herstellung von Stammlösungen entscheidend. Die freie Säure (MW 238.30) ergibt beim Lösen eine stark saure Lösung und muss mit Natronlauge auf den Arbeits-pH-Wert titriert werden. Das Natriumsalz (HEPES-Na, MW 260.29) ergibt beim Lösen eine basische Lösung und wird mit Salzsäure heruntertitriert. Fertige 1 M Lösungen für die Zellkultur sind bereits in das Fenster pH 7.0-7.6 eintitriert und sterilfiltriert, was den Titrationsschritt und die damit verbundene Unsicherheit über die Natriumfracht erspart.

Ein häufig missverstandener Punkt: HEPES ist ein Puffer, kein Nährstoff. Es trägt nichts zum Zellstoffwechsel bei. Bicarbonat ist demgegenüber beides — Puffer und metabolisches Substrat — und speist Carboxylierungsreaktionen, die Zellen tatsächlich benötigen. Deshalb ergänzt HEPES ein Bicarbonatsystem, statt es zu ersetzen.

HEPES hat einen pKa von etwa 7.48 bei 25 °C und puffert wirksam über einen pH-Bereich von rund 6.8 bis 8.2. Ein Puffer arbeitet am besten innerhalb von etwa einer pH-Einheit beiderseits seines pKa, und der physiologische Kultur-pH-Wert von 7.2-7.4 liegt nahezu exakt auf dem pKa von HEPES. Genau darin liegt der Sinn seiner Verwendung: Der Puffer arbeitet dort mit maximaler Pufferkapazität, wo die Zellen sie brauchen.

Die praktische Schwierigkeit besteht darin, dass der pKa von HEPES temperaturabhängig ist und je °C Erwärmung um etwa 0.014 pH-Einheiten nach unten wandert. Die Folge ist konkret und wird regelmäßig übersehen. Eine HEPES-Lösung, die auf der Laborbank bei 22 °C auf pH 7.4 titriert wurde, zeigt nach dem Äquilibrieren bei 37 °C im Inkubator eher pH 7.2 an. Hängt Ihr Experiment von einem definierten pH-Wert bei Arbeitstemperatur ab, titrieren Sie die Stammlösung entweder bei 37 °C oder bei Raumtemperatur auf einen bewusst höheren Sollwert und überprüfen den Wert vor dem Einsatz bei 37 °C.

Die in der Lieferantenliteratur genannten pKa-Werte schwanken leicht (7.31 bei 37 °C, 7.48 bei 25 °C und 7.55 bei 20 °C sind alle im Umlauf), weil sie bei unterschiedlichen Temperaturen und Ionenstärken bestimmt wurden. Sie widersprechen einander nicht; sie beschreiben dieselbe Temperaturkurve an verschiedenen Punkten. Betrieblich zählen Richtung und ungefähre Größe der Verschiebung, nicht die dritte Nachkommastelle.

Auch die Ionenstärke verschiebt den effektiven pKa geringfügig. In einem Komplettmedium bei physiologischer Ionenstärke liegt das Pufferverhalten nahe genug am tabellierten Wert, dass sich eine Korrektur selten lohnt; es ist aber ein weiterer Grund, den pH-Wert in der fertigen Formulierung zu überprüfen, statt der Stammlösung zu vertrauen.

Der Arbeitsbereich in der Säugerzellkultur liegt bei 10-25 mM, wobei 25 mM die häufigste Einzelwahl ist und 10-15 mM für empfindliche Primärzellen und lange Kulturen bevorzugt werden. Oberhalb von etwa 25 mM flacht der Nutzen ab und die unten beschriebenen Risiken beginnen zu überwiegen; Konzentrationen ab 50 mM sind für viele Linien zytotoxisch und werden in der Routinekultur nicht verwendet.

Verdünnungen aus einer 1 M Stammlösung sind unkompliziert:

Zwei Dinge sind zu berücksichtigen, wenn Sie HEPES einem bereits fertigen Medium zusetzen, statt eine Formulierung zu kaufen, die es enthält.

Die Osmolalität steigt. Eine 1 M HEPES-Lösung ist weit höher konzentriert als das Medium, in das sie gelangt, und ihre Zugabe erhöht die Gesamtosmolalität. Säugerzellmedien liegen normalerweise bei 260-320 mOsmol/kg, und eine HEPES-Zugabe am oberen Ende des Arbeitsbereichs kann eine Formulierung, die bereits nahe der Obergrenze lag, darüber hinaus treiben. Medien, die „mit HEPES" verkauft werden, enthalten zum Ausgleich weniger Natriumchlorid; ein Medium, das Sie selbst ergänzen, nicht. Wenn Sie mit osmotisch empfindlichen Zellen arbeiten, messen Sie nach.

Die Natriumfracht steigt. Das Titrieren von HEPES als freier Säure auf pH 7.4 erfordert etwa ein Äquivalent Natronlauge, sodass eine Zugabe von 25 mM HEPES eine vergleichbare Menge zusätzliches Natrium mitbringt. In der Routinekultur ist das vernachlässigbar. In der Elektrophysiologie oder bei sorgfältig osmolalitätskontrollierten Arbeiten ist es das nicht.

Entfernen Sie das Natriumbicarbonat nicht aus einer Formulierung, wenn Sie HEPES zusetzen. Die Standardkonfiguration ist Bicarbonat in der auf Ihren Inkubator abgestimmten Konzentration plus HEPES obendrauf — beide leisten nützliche Arbeit.

Der Standardpuffer in nahezu jedem klassischen Medium ist Natriumbicarbonat im Zusammenspiel mit dem CO2 der Inkubatoratmosphäre. Gelöstes CO2 hydratisiert zu Kohlensäure, die zu Bicarbonat und einem Proton dissoziiert. Der pH-Wert, auf den sich das Medium einstellt, wird durch das Verhältnis von Bicarbonatkonzentration im Medium zu gelöster CO2-Konzentration bestimmt — deshalb muss der Bicarbonatgehalt einer Formulierung auf die Gaseinstellung des Inkubators abgestimmt sein. DMEM mit 3.7 g/L Natriumbicarbonat ist für eine Atmosphäre mit 10% CO2 ausgelegt; Formulierungen mit 1.5-2.2 g/L sind für 5% CO2 ausgelegt. Betreibt man eine Formulierung mit 3.7 g/L bei 5% CO2, bleibt das Medium dauerhaft alkalisch.

Die Schwäche des Bicarbonatsystems ist, dass die eine Hälfte davon ein Gas ist. Nimmt man den Kolben aus dem Inkubator, entweicht CO2 aus dem Medium in die Raumluft, die etwa 0.04% CO2 enthält. Das Bicarbonat bleibt zurück, das Verhältnis verschiebt sich, und der pH-Wert steigt. Unter einer Sicherheitswerkbank kann ein rein bicarbonatgepuffertes Medium innerhalb von zehn bis zwanzig Minuten sichtbar ins Alkalische driften; mit Phenolrot lässt sich das beobachten, wenn das Medium von Rot nach Violett umschlägt.

HEPES hat keinen flüchtigen Bestandteil. Seine Pufferkapazität ist durch die zugesetzte Menge festgelegt und bleibt davon unberührt, was die Atmosphäre tut. Genau diese eine Eigenschaft macht es wertvoll, und sie erklärt jede Situation, in der sich HEPES lohnt.

Der Preis dafür: HEPES liefert kein Bicarbonat-Ion, das Zellen in Carboxylierungsreaktionen verbrauchen, und es bildet die physiologische Pufferchemie nicht nach. Bicarbonat vollständig zugunsten von HEPES wegzulassen, verlangsamt oder stoppt das Wachstum vieler Linien. Die richtige Konfiguration ist in nahezu allen Fällen: beides.

HEPES verdient seinen Platz überall dort, wo Zellen nennenswerte Zeit außerhalb einer kontrollierten CO2-Atmosphäre verbringen:

• Lebendzellmikroskopie auf einem Tisch ohne Gasregelung. Eine Zeitrafferaufnahme von einer Stunde oder länger in Umgebungsluft ist der klassische Fall. 20-25 mM HEPES halten den pH-Wert über diese Dauer.
• Durchflusszytometrie und Zellsortierung. Sortierläufe dauern lange, Proben stehen bei Umgebungs-CO2 in Röhrchen, und die pH-Drift mindert die Viabilität, bevor der Lauf beendet ist.
• Dissoziation von Primärgewebe. Verdaue laufen an der Laborbank in Luft ab, oft über 30 Minuten bis mehrere Stunden. HEPES-gepufferte Dissoziations- und Aufbewahrungsmedien gibt es genau dafür.
• Transport lebender Kulturen. Kolben, die zwischen Gebäuden bewegt oder über Nacht versandt werden, haben keine CO2-Versorgung. HEPES plus ein vollständig gefüllter (nicht begaster) Kolben ist das übliche Vorgehen.
• Häufige oder langwierige Handhabung. Protokolle mit vielen Arbeitsschritten unter der Werkbank sammeln alkalische Drift an; HEPES ebnet sie ein.
• Arbeiten an Neuronen und Gewebeschnitten. Ausgedehnte Elektrophysiologie und Aufbewahrungsmedien für Neurone verwenden aus genau diesem Grund routinemäßig HEPES.

Geht eine Kultur dagegen in einen Inkubator mit 5% CO2, wird zweimal pro Woche gefüttert und ansonsten in Ruhe gelassen, verursacht HEPES Kosten und eine photochemische Gefahr bei sehr geringem Nutzen. Es ist kein Routinezusatz, sondern die Lösung für ein bestimmtes Problem.

Das Lichtproblem ist real und wird am häufigsten übersehen. Zigler und Kollegen zeigten 1985, dass der Zusatz von HEPES zu RPMI 1640 die Bildung zytotoxischer Produkte deutlich erhöht, wenn das Medium sichtbarem Licht ausgesetzt wird, und identifizierten Wasserstoffperoxid als wesentliches zytotoxisches Agens. Die Reaktion benötigt nur HEPES und Riboflavin sowie Licht; die übrigen Medienbestandteile sind nicht erforderlich. In ihren Versuchen hemmte eine dreistündige Lichtexposition der Hälfte des Kulturmediums vor der Zellzugabe die Thymidinaufnahme vollständig.

Die daraus folgenden praktischen Regeln sind einfach: HEPES-Stammlösungen und HEPES-haltige Medien dunkel lagern, Flaschen nicht längere Zeit dem Licht auf der Laborbank aussetzen und nicht länger als nötig auf beleuchteten Mikroskoptischen stehen lassen, und bei unerklärlicher Toxizität eines HEPES-ergänzten Mediums, das unter Licht gestanden hat, misstrauisch werden. Fast jeder Lieferant liefert HEPES aus diesem Grund mit dem Lagerhinweis „vor Licht schützen" aus.

Konzentrationsabhängige Zytotoxizität. Oberhalb des Arbeitsbereichs von 10-25 mM wird HEPES selbst für viele Zelltypen zum Problem. Es gibt keinen einheitlichen Schwellenwert für alle Linien; wenn Sie über 25 mM hinausgehen, titrieren Sie im eigenen System gegen einen Viabilitätsparameter, statt zu vermuten.

Störung von Tests. HEPES ist nicht in jedem Zusammenhang chemisch inert. Es beteiligt sich an Radikalchemie, kann gegenüber manchen Metalloxiden als Reduktionsmittel wirken, und seine Sulfonatgruppe kann bestimmte Protein- und Metallbindungstests stören. Liefert ein pufferempfindlicher Test ein unerwartetes Ergebnis, ist der Puffer ein berechtigter Verdächtiger.

HEPES ersetzt weder Sterilität noch Stabilität. Es verlangsamt den Abbau von L-Glutamin nicht, verhindert kein mikrobielles Wachstum und verlängert nicht die Haltbarkeit eines Mediums.

Für 1 L 1 M HEPES aus der freien Säure lösen Sie 238.30 g in etwa 800 mL zellkulturtauglichem Wasser, titrieren mit Natronlauge (typischerweise 5 M oder 10 M, um die Verdünnung gering zu halten) auf den Ziel-pH-Wert, füllen auf 1 L auf und sterilisieren anschließend durch Filtration über 0.22 µm. Für Zellkultur-Stammlösungen ist die Sterilfiltration dem Autoklavieren vorzuziehen; die Hitzebehandlung kann HEPES-Lösungen verfärben, und es gibt keinen Nutzen, der das Risiko aufwiegt.

Punkte, die die Qualität des Ergebnisses beeinflussen:

1. Wasser bekannter Qualität verwenden. Die HEPES-Stammlösung wird direkt einem Medium zugesetzt, in dem Zellen leben werden — das Wasser geht also unverändert mit ein. Zellkulturtaugliches destilliertes Wasser mit spezifiziert niedrigem Endotoxingehalt ist der richtige Ausgangsstoff; deionisiertes Laborwasser mit unbekanntem Endotoxingehalt nicht.
2. Bei der Temperatur titrieren, bei der Sie arbeiten wollen. Siehe den Abschnitt zum pKa weiter oben. Der Messwert bei Raumtemperatur ist nicht der Wert im Inkubator.
3. Filtrieren, nicht autoklavieren. 0.22 µm, und mit Datum beschriften.
4. Kalt und dunkel lagern. 2-8 °C, vor Licht geschützt, ist die übliche Bedingung für die flüssige Stammlösung. Das Pulver ist unempfindlicher und wird normalerweise bei Umgebungstemperatur vor Licht geschützt gelagert.
5. Auf Endotoxin achten. Puffer sind ein häufiger und zu selten geprüfter Eintragsweg für Endotoxin in eine Kultur. Ist Ihre Arbeit endotoxinempfindlich (primäre Immunzellen, Stammzellen, alles mit Blick auf eine regulierte Anwendung), verwenden Sie eine Stammlösung mit angegebener Endotoxinspezifikation statt einer aus nicht spezifizierten Reagenzien hergestellten.

Für Labore, die große Medienvolumina aus Pulver ansetzen, ist der Kauf von HEPES als Massenpulver mit hauseigener Titration je Mol deutlich günstiger als der Kauf steriler 1 M Lösung. Für Labore, die einzelne Flaschen Komplettmedium ergänzen, ist die sterile 1 M Lösung die pragmatische Wahl: kein Einwiegen, kein Titrieren, kein Filtrationsschritt und keine Gelegenheit, eine Medienpartie mit einer selbst hergestellten Stammlösung zu kontaminieren.