Trypsin-EDTA

Trypsin ist eine Serinprotease. In der Bauchspeicheldrüse verdaut sie Nahrungsprotein; in der Zellkultur tut sie dasselbe mit den Proteinen, die eine Zelle an ihre Nachbarn und an den Kunststoff binden. Sie spaltet Peptidbindungen gezielt auf der Carboxylseite von Lysin- und Argininresten, die in Adhäsionsproteinen häufig genug vorkommen, dass wenige Minuten Einwirkzeit ausreichen, um einen Monolayer abzulösen.

Das in der Zellkultur verwendete Trypsin ist normalerweise rohes Schweinepankreas-Trypsin, das als bestrahltes Pulver geliefert und über eine Aktivitätsangabe statt über einen Reinheitsgrad spezifiziert wird: 1:250 bedeutet, dass ein Teil des Pulvers unter definierten Bedingungen 250 Teile Casein verdaut. Das ist kein Reinheitsgrad, und eine 1:250-Präparation enthält neben Trypsin weitere Pankreasproteasen. Diese Mischung ist ein Grund dafür, dass rohes Trypsin bei zähem Primärgewebe gut funktioniert — und ein Grund dafür, dass es empfindliche Zellen härter angreift als ein gereinigtes oder rekombinantes Enzym.

EDTA steckt aus einem bestimmten Grund in der Formulierung, den man besser versteht als auswendig lernt. Die wichtigsten Zelladhäsionssysteme sind von zweiwertigen Kationen abhängig. Cadherine, die die Zell-Zell-Adhäsion vermitteln, benötigen Calcium, um ihre extrazellulären Domänen in der starren, bindungsfähigen Konformation zu halten; entzieht man das Calcium, werden die Domänen beweglich und die Adhäsion versagt. Integrine, die die Adhäsion an das Substrat vermitteln, benötigen zweiwertige Kationen an ihrer metallionenabhängigen Adhäsionsstelle. EDTA komplexiert Calcium und Magnesium und schaltet beide Systeme aus.

Es gibt einen zweiten, weniger offensichtlichen Effekt. Zweiwertige Kationen in der extrazellulären Matrix schirmen die Peptidbindungen, die Trypsin erreichen muss, physikalisch ab. Ihre Entfernung legt diese Stellen frei. EDTA lockert die Adhäsion also nicht nur parallel zum Trypsin — es macht das Trypsin selbst wirksamer. Diese Synergie ist der Grund, warum Trypsin-EDTA schneller und bei niedrigerer Enzymkonzentration wirkt als Trypsin allein.

Dieselbe Logik erklärt die dritte Komponente, an die man selten denkt: die Basislösung ist immer Calcium- und Magnesium-frei. Trypsin-EDTA wird genau deshalb in Ca/Mg-freiem HBSS oder PBS formuliert, damit der Puffer nicht wieder die Ionen zuführt, die das EDTA gerade entfernt hat. Wer einen Monolayer unmittelbar vor der Trypsinierung mit calciumhaltigem PBS wäscht, hebelt das Konzept aus.

Die Prozentangabe bezieht sich auf den Trypsingehalt als Masse pro Volumen. 0.05% entspricht 0.5 g/L; 0.25% entspricht 2.5 g/L — ein fünffacher Unterschied an Enzym.

0.05% Trypsin-EDTA ist die Standardwahl für die meisten etablierten adhärenten Zelllinien — HeLa, CHO, Vero, NIH-3T3, MDCK und ähnliche — und für alles, was schonend behandelt werden soll. Das 0.05%-Produkt von Gibco ist mit 0.5 g/L Trypsin (1:250) und 0.2 g/L EDTA-4Na in Calcium- und Magnesium-freiem HBSS mit Phenolrot formuliert.

0.25% Trypsin-EDTA wird für Zellen verwendet, die sich der Ablösung widersetzen: fest anhaftende Linien, Zellen, die über die Konfluenz hinausgewachsen sind und viel extrazelluläre Matrix abgelagert haben, manche Primärkulturen sowie Gewebefragmente. Das 0.25%-Produkt von Gibco enthält 2.5 g/L Trypsin (1:250) mit 0.38 g/L EDTA-4Na in derselben Basis. Das entsprechende Produkt von Sigma verwendet 2.5 g/L Schweinetrypsin mit 0.2 g/L EDTA-4Na in HBSS mit Phenolrot — der EDTA-Gehalt schwankt also zwischen den Anbietern, grob im Bereich von 0.4-0.9 mM, und ist keine standardisierte Größe.

Die praktische Regel lautet, die niedrigste Konzentration und die kürzeste Zeit zu verwenden, mit der sich die Zellen lösen. Mehr Enzym ist keine Lösung für eine langsame Ablösung; es ist meist ein Symptom eines der weiter unten aufgeführten Probleme (Serumverschleppung, kaltes Reagenz, Calcium im Waschschritt). Zellen, die 0.25% über zehn Minuten brauchen, sind Zellen, die Sie schädigen.

Manche Labore halten eine 0.25%-Stammlösung vor und verdünnen sie bei Bedarf mit Ca/Mg-freiem PBS auf 0.05%. Das funktioniert, ist günstiger und völlig vertretbar, sofern das Verdünnungsmittel steril und calciumfrei ist. Beachten Sie, dass mit dem Trypsin auch das EDTA verdünnt wird, was das Gleichgewicht des Reagenzes verändert.

Trypsin ohne EDTA gibt es, und es hat echte Anwendungen: Arbeiten, bei denen die Komplexierung zweiwertiger Kationen die untersuchte Biologie stören würde, sowie Anwendungen, bei denen verschlepptes EDTA ein nachgelagertes, auf zweiwertige Kationen angewiesenes Enzym lahmlegen würde. Es löst Zellen langsamer ab als das kombinierte Reagenz.

Mit oder ohne Phenolrot ist eine Frage der Formulierung, nicht der Funktion. Phenolrot macht das Reagenz gut sichtbar und pH-Probleme leicht erkennbar; es entfällt bei Fluoreszenzarbeiten, bei denen sein Hintergrund stört, und bei nachgelagerten Anwendungen, in denen kein Farbstoff erwünscht ist.

Die meisten Labore kaufen Trypsin-EDTA gebrauchsfertig, doch die Herstellung aus Pulver ist bei großen Mengen günstiger und die einzige Möglichkeit, wenn Sie eine Formulierung brauchen, die niemand verkauft. Die veröffentlichten Gibco-Formulierungen sind die Zielvorgabe.

0.25% Trypsin-EDTA, pro Liter

Für 0.05% Trypsin-EDTA verwenden Sie 0.5 g desselben Pulvers pro Liter, mit 0.2 g/L EDTA-Tetranatrium.

Vorgehen

1. Kühlen Sie die Basislösung. Bringen Sie das Ca/Mg-freie HBSS oder PBS vor Beginn auf 2-8 °C. Trypsin ist eine Protease und verdaut sich selbst; jede Minute, die es während der Herstellung warm und konzentriert verbringt, ist verlorene Aktivität, noch bevor die Flasche fertig ist.
2. Lösen Sie zuerst das EDTA. Es geht leicht in Lösung und braucht keine besondere Behandlung.
3. Geben Sie das Trypsinpulver langsam zu und rühren Sie vorsichtig, während das Gefäß kalt bleibt. Erwärmen Sie nicht, um das Lösen zu beschleunigen, und rühren Sie nicht so kräftig, dass Schaum entsteht — Proteine denaturieren an Grenzflächen zwischen Luft und Flüssigkeit.
4. Prüfen Sie den pH-Wert. Trypsin-EDTA-Lösungen werden üblicherweise bei pH 7.2-8.0 formuliert. Stellen Sie bei Bedarf mit verdünnter Natronlauge oder Salzsäure ein.
5. Füllen Sie auf das Endvolumen auf und sterilfiltrieren Sie über eine 0.22 µm Membran. Niemals autoklavieren — Hitze zerstört das Enzym vollständig. Trypsinlösungen setzen Filter zu; verwenden Sie daher einen Vorfilter und mehr Membranfläche, als das Volumen nahelegt.
6. Aliquotieren Sie sofort in Einmalvolumina und frieren Sie nur einmal ein, bei -30 bis -5 °C und vor Licht geschützt. Das ist kein optionaler Rat: Eine Flasche, die wiederholt aufgetaut und erneut eingefroren wird, verliert stetig und unsichtbar an Aktivität — der Hauptgrund dafür, dass selbst angesetztes Trypsin den Ruf hat, unzuverlässig zu sein.

Das Einwiegen des Pulvers erfordert Sorgfalt. Trypsinpulver wirkt sensibilisierend auf die Atemwege. Wiegen Sie es im Abzug oder mit örtlicher Absaugung ein und vermeiden Sie Staubentwicklung.

Die Wasserqualität schlägt direkt durch. Wenn Sie neben der Enzymlösung auch die Basislösung selbst ansetzen, verwenden Sie Wasser in Zellkulturqualität mit angegebener niedriger Endotoxinspezifikation.

Eine Anmerkung dazu, was Sie einkaufen. Die Angabe 1:250 auf dem Pulver ist eine Aktivitätsangabe und kein Reinheitsgrad, und verschiedene Chargen rohen Schweinetrypsins schwanken. Wenn Ihnen die Reproduzierbarkeit über Monate wichtiger ist als der Preis pro Liter, ist eine gebrauchsfertige Lösung mit spezifizierter Aktivität die bessere Wahl — und rekombinante trypsinähnliche Reagenzien beseitigen das Problem der Chargenschwankung vollständig.

Die folgenden Volumina gelten für eine T-75-Flasche bei 80-90% Konfluenz. Skalieren Sie proportional zur Wachstumsfläche.

1. Wärmen Sie die Reagenzien an. Bringen Sie Trypsin-EDTA, Ca/Mg-freies DPBS und Vollmedium auf Raumtemperatur oder 37 °C. Die Trypsinaktivität bei 4 °C beträgt nur einen Bruchteil der Aktivität bei 37 °C, und kaltes Reagenz ist die mit Abstand häufigste Ursache dafür, dass eine Ablösung "nicht funktioniert".
2. Entfernen Sie das verbrauchte Medium vollständig. Saugen Sie alles ab. Serum im Restmedium enthält Proteaseinhibitoren, die das Trypsin sofort nach der Zugabe neutralisieren.
3. Waschen Sie den Monolayer. Geben Sie 5-10 mL Calcium- und Magnesium-freies DPBS zu, schwenken Sie vorsichtig und saugen Sie ab. Das entfernt sowohl Restserum als auch Restcalcium. Verwenden Sie einen Ca/Mg-freien Waschschritt — DPBS mit Calcium und Magnesium arbeitet gegen das EDTA. Ein Waschschritt reicht meist aus; zwei, wenn die Kultur in serumreichem Medium stand.
4. Geben Sie Trypsin-EDTA zu. 2-3 mL bei 0.25% oder 1-2 mL bei 0.05%. Schwenken Sie die Flasche, bis die gesamte Fläche bedeckt ist, und entfernen Sie bei empfindlichen Zellen den größten Teil des Überschusses — ein dünner Film genügt, und weniger Reagenz bedeutet weniger, das später neutralisiert werden muss.
5. Inkubieren Sie bei 37 °C. 2-5 Minuten für die meisten Linien. Gehen Sie nicht weg. Kontrollieren Sie die Flasche nach 2 Minuten unter dem inversen Mikroskop: Die Zellen sollten sich abrunden und beginnen, sich abzulösen.
6. Lösen Sie die Zellen. Wenn die meisten Zellen abgerundet sind, klopfen Sie mit dem Handballen scharf gegen die Seite der Flasche. Die Zellen sollten sich flächig lösen. Tun sie das nicht, stellen Sie die Flasche für 1 Minute zurück in den Inkubator und kontrollieren Sie erneut, statt blind zu verlängern.
7. Neutralisieren Sie sofort. Geben Sie 6-8 mL Vollmedium mit mindestens 5-10% Serum zu oder ein gleiches Volumen mit einem definierten Trypsininhibitor, falls Sie serumfrei arbeiten. Pipettieren Sie vorsichtig gegen die Wachstumsfläche auf und ab, um Zellklumpen aufzulösen und die Zellen aufzunehmen.
8. Zentrifugieren Sie. 200-300 x g für 5 Minuten. Höhere Drehzahlen schädigen die Zellen, ohne die Ausbeute zu verbessern.
9. Resuspendieren und zählen. Verwerfen Sie den Überstand, der Trypsin und Inhibitor mitnimmt, resuspendieren Sie das Pellet in frischem Vollmedium, zählen Sie mit Trypanblau und säen Sie im erforderlichen Teilungsverhältnis aus.

Ungefähre Trypsin-EDTA-Volumina nach Gefäß

Trypsin hört nicht von selbst auf, und Zellen, die darin verbleiben, werden weiter verdaut. Es gibt drei Wege, die Reaktion zu beenden, und sie sind nicht austauschbar.

Serumhaltiges Medium. Serum enthält Alpha-1-Antitrypsin und Alpha-2-Makroglobulin, die Trypsin direkt hemmen. Die Zugabe von zwei bis drei Volumina Medium mit 5-10% Serum stoppt die Reaktion praktisch sofort. Das ist der Standardweg und der Grund, warum die Trypsinierung in serumhaltiger Kultur unkompliziert ist.

Definierter Trypsininhibitor. In serumfreier Kultur stoppt die Zugabe von serumfreiem Medium das Trypsin nicht — sie verdünnt es nur, und die Zellen werden weiter geschädigt. Der Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI) ist die übliche definierte Alternative: ein einzelnes Polypeptid, das mit Trypsin einen stabilen, enzymatisch inaktiven Eins-zu-eins-Komplex bildet. Er wird in etwa äquimolarer Menge zum vorhandenen Trypsin zugegeben. SBTI hemmt Trypsin, Faktor Xa, Plasmin und Plasmakallikrein, hat aber keine Wirkung auf Metallo-, Cystein- oder Aspartatproteasen — was wissenswert ist, wenn Ihr Dissoziationsgemisch zusätzlich Kollagenase oder Dispase enthält.

Verdünnung allein, die nur bei Reagenzien ausreicht, die dafür ausgelegt sind. Rekombinante trypsinähnliche Reagenzien vom Typ TrypLE werden durch Verdünnung inaktiviert und benötigen keinen Inhibitor — einer der Gründe, warum sie in serumfreien und von tierischen Bestandteilen freien Arbeitsabläufen praktisch sind. Setzen Sie dieses Verhalten bei herkömmlichem Schweinetrypsin nicht voraus.

In jedem Fall gilt: Entfernen Sie den Inhibitor durch Zentrifugation und Resuspension in frischem Medium. Bleiben Trypsin und Inhibitor in der Aussaatsuspension, werden Protein und Proteaseinhibitor-Aktivität in die nächste Passage verschleppt, und insbesondere restliches SBTI kann nachfolgende Experimente beeinflussen.

Übertrypsinierung. Der häufigste und schädlichste Fehler. Anzeichen sind eine niedrige Viabilität nach der Passage, Zellen, die bei der nächsten Aussaat schlecht oder langsam anwachsen, körnige oder blasenbildende Zellen unter dem Mikroskop sowie Verklumpung durch DNA aus lysierten Zellen. Weniger sichtbar: Trypsin spaltet Zelloberflächenproteine — die Rezeptoren und Marker auf der Zellaußenseite sind Substrate wie alle anderen. Verliert ein durchflusszytometrisches Panel nach der Trypsinierung einen Marker, der in denselben Zellen nach der Ernte mit EDTA allein vorhanden war, hat das Enzym das Epitop gespalten. Für Arbeiten mit Oberflächenmarkern verwenden Sie eine reine EDTA-Dissoziation oder ein schonenderes Reagenz, oder lassen Sie die Zellen vor der Färbung 30-60 Minuten in Medium regenerieren.

Unvollständige Trypsinierung. Zellinseln bleiben angeheftet. Das ist kein neutrales Ergebnis: Die zuerst abgelösten Zellen sind keine Zufallsstichprobe, sodass eine wiederholt unvollständige Trypsinierung über viele Passagen hinweg unbemerkt eine Subpopulation selektiert. Nehmen Sie den gesamten Monolayer mit oder beginnen Sie neu.

Serumverschleppung — der häufigste Grund, warum Trypsin "nicht wirkt". Jedes verbliebene serumhaltige Medium neutralisiert das Trypsin bei Kontakt. Gründlich absaugen und waschen. Wenn die Ablösung unerwartet langsam verläuft, ist dies das Erste, was zu prüfen ist — vor jeder Erhöhung von Konzentration oder Zeit.

Calcium im Waschpuffer. Ein Waschschritt mit DPBS, das Calcium und Magnesium enthält, unmittelbar vor der Zugabe von Trypsin-EDTA führt genau die Ionen zurück, die das EDTA entfernen soll. Verwenden Sie die Ca/Mg-freie Formulierung.

Kaltes Reagenz. Trypsin ist bei Kühlschranktemperatur träge. Wärmen Sie es an.

Überkonfluente Kulturen. Zellen jenseits der Konfluenz lagern erhebliche extrazelluläre Matrix ab und lassen sich zunehmend schwerer ablösen, was zu längeren Verdauzeiten verleitet, die sie schädigen. Passagieren Sie, bevor der Monolayer vollständig konfluent ist.

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Trypsin ist eine Protease und verdaut sich selbst. Jeder Gefrier-Tau-Zyklus kostet Aktivität, und eine Flasche, die fünfmal aufgetaut und wieder eingefroren wurde, verhält sich unvorhersehbar. Aliquotieren Sie bei Erhalt in Einmalvolumina und frieren Sie nur einmal ein.

Trypsin wiederverwenden. Tun Sie es nicht. Neben dem offensichtlichen Kontaminationsrisiko, ein Reagenz mit Zellkontakt in die Vorratsflasche zurückzugeben, ist die Aktivität von gebrauchtem Trypsin unbekannt — es ist teils vom Substrat verbraucht und teils durch verschlepptes Serum gehemmt.

EDTA-Verschleppung in nachgelagerte Enzymschritte. EDTA komplexiert die zweiwertigen Kationen, die Metalloproteasen benötigen. Führt man mit Trypsin-EDTA behandelte Zellen direkt in einen Kollagenase- oder Dispase-Verdau über, werden diese Enzyme gehemmt, teils vollständig. Waschen Sie zwischen den Schritten in einem Puffer mit zweiwertigen Kationen.

Schweinepankreas-Trypsin ist ein tierisch gewonnenes Reagenz, was aus drei Gründen zählt: regulatorische Erwartungen in Zelltherapie und Bioproduktion, die einem rohen Gewebeextrakt eigene Chargenschwankung und das theoretische Risiko von Fremdagenzien. Mehrere Alternativen greifen das auf.

Rekombinante trypsinähnliche Proteasen. Durch mikrobielle Fermentation hergestellt statt aus Pankreas extrahiert, liefern sie ein einzelnes definiertes Enzym statt eines Proteasegemischs. Die Dissoziationskinetik ist mit Schweinetrypsin vergleichbar bei geringerer Zytotoxizität, sie sind bei Raum- und Kühltemperatur stabil statt tiefgekühlt gelagert werden zu müssen, und Verdünnung allein inaktiviert sie, was Serum oder Inhibitor überflüssig macht. Sie sind der direkteste Ersatz für herkömmliches Trypsin in einem serumfreien Arbeitsablauf.

Reine EDTA-Dissoziation (Versene). Eine einfache Komplexbildnerlösung, typischerweise 0.5 mM EDTA in Ca/Mg-freiem PBS, ganz ohne Enzym. Da nichts gespalten wird, bleiben Oberflächenproteine intakt — dies ist das Reagenz der Wahl, wenn eine nachfolgende Durchflusszytometrie von Oberflächenepitopen abhängt. Es ist außerdem die Standardmethode, um humane pluripotente Stammzellen als Zellaggregate zu passagieren, wo eine enzymatische Vereinzelung Probleme verursacht. Die Nachteile: Es ist langsamer, es löst fest anhaftende Zellen überhaupt nicht ab, und die Zellen kommen in Verbänden und Klumpen statt als Einzelzellsuspension.

Enzymfreie, chemisch definierte Dissoziationsmedien. Fertige Alternativen, die Komplexierung mit weiteren nicht-enzymatischen Mechanismen verbinden und mehr Konstanz bieten als EDTA allein, während Oberflächenproteine intakt bleiben.

Reagenzien vom Accutase-Typ. Gemischte proteolytische und kollagenolytische Aktivität nicht-säugetierischen Ursprungs. Für viele Zelltypen schonender als rohes Trypsin und weit verbreitet für Stammzellen und Neurone, wobei direkte Vergleiche in manchen Systemen mit rekombinanten trypsinähnlichen Reagenzien eine bessere Viabilität berichtet haben als mit Accutase.

Die Wahl richtet sich danach, was Sie erhalten müssen. Geht es um Oberflächenepitope, nehmen Sie EDTA oder ein enzymfreies Reagenz. Geht es um regulatorische Konformität und Reproduzierbarkeit, nehmen Sie ein rekombinantes Enzym. Geht es um Tempo bei einer widerspenstigen Primärkultur, hat rohes 0.25% Trypsin-EDTA weiterhin die Nase vorn — es ist gerade deshalb hart, weil es ein Gemisch aus Proteasen ist, und manchmal ist genau das nötig.

Flüssiges Trypsin-EDTA wird normalerweise gefroren gelagert, typischerweise bei -30 bis -5 °C und vor Licht geschützt, mit einer Haltbarkeit von rund 24 Monaten. Einmal aufgetaut, behält eine bei 2-8 °C gehaltene Gebrauchsflasche für einige Wochen brauchbare Aktivität, auch wenn diese durch Autolyse stetig abnimmt; notieren Sie das Auftaudatum.

Aliquotieren Sie bei Erhalt. Tauen Sie die Flasche einmal auf, teilen Sie sie in Einmalvolumina passend zu Ihrer tatsächlichen Arbeitsweise und frieren Sie diese wieder ein. Das ist die wertvollste einzelne Gewohnheit im Umgang mit Trypsin, denn sie beseitigt den Aktivitätsverlust durch Gefrier-Tau-Zyklen, der Ergebnisse über Monate abdriften lässt.

Rekombinante trypsinähnliche Reagenzien sind in der Regel bei 2-8 °C und oft bei Raumtemperatur stabil, was das Gefrier-Tau-Problem vollständig beseitigt und einer ihrer praktischen Vorteile ist.

Sterilität. Trypsin-EDTA ist sterilfiltriert und enthält kein Konservierungsmittel. Es kommt direkt mit Zellen in Kontakt und ist ein häufiger Weg für Kontaminationen in eine ansonsten saubere Kultur. Gießen Sie ab, statt aus der Vorratsflasche zu pipettieren, geben Sie ungenutztes Reagenz nicht zurück und verwerfen Sie jede Flasche, die trüb aussieht.

pH-Wert und Phenolrot. Trypsin-EDTA-Lösungen werden typischerweise bei pH 7.2-8.0 formuliert. Bei phenolrothaltigen Formulierungen bedeutet eine gelb gewordene Flasche einen abgefallenen pH-Wert, was meist auf eine Kontamination oder zu langes Stehen im Warmen hinweist — verwerfen Sie sie.

Persönlicher Schutz. Trypsinpulver wirkt sensibilisierend auf die Atemwege und sollte mit Absaugung eingewogen werden; die gebrauchsfertigen Lösungen sind wenig gefährlich. Für jedes im Labor verwendete Material tierischen Ursprungs gelten die üblichen Vorgehensweisen.