DF-1 Hühnerembryo-Fibroblastenzellen

DF-1, formal UMNSAH/DF-1 und hinterlegt als ATCC CRL-12203, wurde aus Hühnerembryo-Fibroblasten der East Lansing Line 0 (EV-0) etabliert. Die Wahl dieser Ausgangslinie ist die wichtigste einzelne Tatsache über diese Zelllinie.

Die meisten Hühnergenome tragen endogene provirale Loci des aviären Leukosevirus (ev) -- retrovirale Sequenzen, die in die Keimbahn integriert sind, exprimiert werden können und dabei virale Proteine und Partikel hervorbringen. Für die meisten Zwecke ist das ohne Belang, für die Forschung an aviären Retroviren und für die Impfstoffherstellung ist es jedoch ein ernster Störfaktor: Ein Nachweis für exogenes aviäres Leukosevirus kann ein eingebrachtes Virus nicht sauber von einem endogenen unterscheiden, und ein Impfstoffsubstrat, das endogene retrovirale Sequenzen exprimiert, ist regulatorisch ein Problem. Die East Lansing Line 0 ist frei von ev-Loci, und DF-1 erbt diese Freiheit. Die Linie gilt als die einzige leicht verfügbare, spontan immortalisierte aviäre Zelllinie, die frei von endogenen Viren ist.

Die Immortalisierung erfolgte spontan. Primäre Hühnerembryo-Fibroblasten wurden in Kultur durch Krise und Seneszenz geführt, und es entstand eine Population, die sich unbegrenzt weiter teilte. Es wurde kein Onkogen eingebracht, kein Virus eingesetzt und kein chemisches Karzinogen angewendet. Das ist wichtig, weil viral transformierte Linien die Sequenzen des transformierenden Agens in jedes Experiment mittragen.

Was der Immortalisierung zugrunde liegt. Publizierte Charakterisierungen führen den immortalen Phänotyp auf eine veränderte Expression von Regulatoren des Zellzyklus und des Zelltods zurück, namentlich auf dysfunktionales p53 und E2F-1, begleitet von Veränderungen in der Expression antioxidativer Gene. DF-1 ist daher in seiner Wachstumskontrolle kein normaler diploider Fibroblast, auch wenn es ebenso wenig eine viral transformierte Linie ist. Ohne diesen Vorbehalt sollte die Linie nicht als Modell für das Zellzyklusverhalten normaler primärer Fibroblasten dienen.

Morphologie und Wachstum. DF-1-Zellen sind adhärente, spindelförmige Fibroblasten, die einen Zellrasen mit dem für Fibroblastenkulturen typischen parallel ausgerichteten Erscheinungsbild bei Konfluenz bilden. Sie wachsen deutlich schneller als primäre CEF und lassen sich effizient transfizieren -- beides praktische Vorteile für die Routinearbeit.

Standardmedium. Dulbecco's Modified Eagle Medium mit hohem Glucosegehalt, supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum, bei 37 °C in 5% CO2. Dies ist die Bedingung, die in den meisten publizierten DF-1-Arbeiten verwendet wird, und ein sinnvoller Ausgangspunkt.

Zur Temperatur. Die Körpertemperatur des Huhns liegt bei etwa 41 °C, und manche Protokolle der aviären Virologie kultivieren DF-1 oder vermehren einzelne Viren bei 38.5-39 °C, um die Wirtsbedingungen besser abzubilden. DF-1 toleriert diesen Bereich. Sofern Ihr Virus oder Ihr Assay die erhöhte Temperatur nicht ausdrücklich verlangt, ist 37 °C der Standard und direkt mit dem Großteil der Literatur vergleichbar. Welche Temperatur Sie auch wählen: Halten Sie sie über ein Experiment hinweg konstant und geben Sie sie in Ihren Methoden an, denn die Replikationskinetik einiger aviärer Viren unterscheidet sich messbar zwischen 37 °C und 39 °C.

Supplemente. Manche Protokolle geben zusätzlich oder anstelle eines Teils des FBS 2-10% Hühnerserum zu, andere setzen Tryptose-Phosphat-Bouillon zu; beides stammt aus der Praxis mit primären CEF. Für das routinemäßige Wachstum von DF-1 ist keines von beiden erforderlich.

Subkultivierung. DF-1 ist eine gewöhnliche adhärente Linie und wird konventionell passagiert: Waschen mit calcium- und magnesiumfreiem PBS oder DPBS, Ablösen mit Trypsin-EDTA, Neutralisieren mit serumhaltigem Medium oder einem definierten Trypsininhibitor, danach erneutes Aussäen. Teilungsverhältnisse von 1:3 bis 1:8 zweimal wöchentlich passen zu den meisten Laborabläufen.

Lassen Sie Kulturen nicht überwachsen. Fibroblasten, die längere Zeit in Konfluenz gehalten werden, ändern ihr Verhalten, und DF-1-Kulturen, die wiederholt dicht überwachsen durften, verlieren an Transfektionseffizienz und unterstützen die Virusreplikation schlechter. Passagieren Sie, bevor der Zellrasen dicht gepackt ist.

Passagenzahl. Auch eine immortalisierte Linie driftet. Legen Sie früh eine Arbeitsbank an, dokumentieren Sie die Passagenzahl und greifen Sie auf eingefrorene Bestände zurück, statt eine Kultur unbegrenzt weiterzuführen. Bei jeder Arbeit, deren Messwert der Virustiter ist, halten Sie das Passagenfenster konstant, denn Titer aus Zellen hoher und niedriger Passagenzahl sind nicht immer vergleichbar.

Kryokonservierung. DF-1 lässt sich unter Standardbedingungen gut einfrieren und erholt sich gut: ein serumhaltiges oder definiertes Einfriermedium mit DMSO als Kryoprotektivum, kontrollierte Abkühlung mit etwa 1 °C pro Minute auf -80 °C, danach Überführung in die Gasphase über flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung.

Die Standardformulierung aus DMEM plus 10% FBS funktioniert, doch für alles, was in Richtung Herstellung geht, ist sie der falsche Ausgangspunkt -- und es gibt gute Gründe dafür, dass eigens entwickelte serumfreie Medien für DF-1 existieren.

Warum man gerade bei dieser Zelllinie vom Serum wegkommen sollte:

• Impfstoff- und Biologikaherstellung. DF-1 dient als Substrat für die Produktion aviärer Impfstoffe und für die Herstellung rekombinanter Viren. Der Wegfall eines Rohstoffs bovinen Ursprungs beseitigt einen Eintragsweg für Fremdagenzien und vereinfacht sowohl das Zulassungsdossier als auch die Lieferkette. Das ist der wichtigste Treiber.
• Virusaufreinigung. Serum liefert einen großen, variablen Proteinhintergrund, der nachgelagert vom Virus abgetrennt werden muss. Eine serumfreie Ernte lässt sich deutlich leichter klären und aufreinigen, besonders bei einem Produkt, das auf einen Dichtegradienten oder eine Chromatographiesäule gegeben wird.
• Titerkonstanz. Der Virustiter reagiert empfindlich auf den physiologischen Zustand der Wirtszelle, und Chargenschwankungen des Serums schlagen unmittelbar auf die Titerschwankung durch. Der Verzicht auf Serum entfernt eine unkontrollierte Größe aus einer ohnehin verrauschten Messung.
• Skalenökonomie. Oberhalb des Labormaßstabs ist Serum ein erheblicher Kostenfaktor und ein Beschaffungsrisiko.

Formulierungen für DF-1 sind typischerweise frei von tierischen Bestandteilen, je nach Prozess für den Suspensions- oder den Adhärenzbetrieb gepuffert und werden mit L-Glutamin oder dem stabileren Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin geliefert. Letzteres ist erwähnenswert: Glutamin zerfällt in Lösung zu Ammoniak, das toxisch ist und sich anreichert, und die Dipeptidform verringert dies erheblich. Für den Maßstabstransfer sind Pulverformate erhältlich, wenn die Medienherstellung im eigenen Haus wirtschaftlicher ist als der Versand von Flüssigmedium.

Adaptation. Führen Sie die Zellen schrittweise und nicht in einem einzigen Schritt hinüber -- reduzieren Sie das Serum über mehrere Passagen stufenweise und lassen Sie Wachstumsrate und Viabilität auf jeder Stufe wieder ansteigen, bevor Sie fortfahren. Legen Sie vor dem Beginn eine Zellbank an, falls die Adaptation scheitert, und banken Sie die adaptierte Linie sofort ein, sobald sie stabil ist. Rechnen Sie damit, für die Subkultivierung einen definierten Trypsininhibitor oder ein rekombinantes Dissoziationsreagenz zu benötigen, denn ohne Serum fehlen die Proteaseinhibitoren, welche die Trypsinierung stoppen. Adhärente Zellen verlieren mit dem Serum auch Fibronektin und Vitronektin, sodass eine beschichtete Oberfläche nötig werden kann.

Nach der Adaptation neu validieren. Bestätigen Sie, dass Virusreplikation und Titer im serumfreien System dem entsprechen, was Sie mit Serum erreicht haben, bevor Sie sich auf den neuen Prozess verlassen. Zellen können in einem neuen Medium einwandfrei wachsen und die Virusreplikation dennoch anders unterstützen.

Ersatz für primäre Hühnerembryo-Fibroblasten. Primäre CEF werden durch Dissoziation von Embryonen aus spezifiziert pathogenfreien Eiern gewonnen, und dieses Vorgehen hat hartnäckige praktische Nachteile: Es setzt eine verlässliche Versorgung mit SPF-Eiern voraus, ist arbeitsintensiv, die Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer und müssen wiederholt frisch angelegt werden, und -- der in der Literatur am häufigsten genannte Punkt -- die Virustiter schwanken von Charge zu Charge. DF-1 beseitigt all das. Die Linie ist durchgehend verfügbar, verhält sich zwischen den Präparationen gleichbleibend, und ihr genetischer Hintergrund liegt fest.

Arbeiten mit aviären Leukose- und Sarkomviren. Dafür wurde der ev-freie Hintergrund der Linie geschaffen. DF-1 hat sich als Ersatz für primäre CEF beim Nachweis aviärer Leukoseviren durchgesetzt, denn das Fehlen endogener Proviren bedeutet, dass ein Assay-Signal eindeutig exogenes Virus widerspiegelt. Die Linie unterstützt außerdem ALV-J, eine Untergruppe, die in manchen anderen Systemen schlecht wächst. Damit verbunden ist DF-1 der Standardwirt für RCAS-basierte retrovirale Vektoren, das von ALV abgeleitete aviäre Vektorsystem für den Gentransfer in der aviären und der Entwicklungsbiologie.

Virusvermehrung allgemein. DF-1 unterstützt die Replikation eines breiten Spektrums aviärer Viren, darunter aviäre Influenza (sowohl niedrig- als auch hochpathogene Isolate), das Virus der infektiösen Bursitis, aviäre Reoviren, das Newcastle-Disease-Virus, das Virus der Marekschen Krankheit und Geflügelpocken. Für mehrere davon ist die Replikation vergleichbar mit oder höher als in primären CEF.

Impfstoffentwicklung und -herstellung. DF-1 wurde im direkten Vergleich mit CEF-basierten Präparationen als Substrat für aviäre Impfstoffe geprüft, einschließlich vergleichender Studien zu Sicherheit, Immunogenität und Wirksamkeit von Impfstoffen gegen die infektiöse Bursitis in spezifiziert pathogenfreien Hühnern. Ein kontinuierliches, charakterisiertes, endogenvirusfreies Substrat lässt sich erheblich leichter qualifizieren und beherrschen als eine Primärzelle, die jedes Mal neu aus Eiern gewonnen wird.

Produktion rekombinanter Proteine und Viren. Hohe Transfektionseffizienz und schnelles Wachstum machen DF-1 nützlich für die Herstellung rekombinanter aviärer Viren und für die Expression aviärer Proteine in einem homologen Wirt, wo korrekte Faltung und artgerechte posttranslationale Modifikation wichtig sind.

DF-1 unterstützt die Virusreplikation gut, und ein Grund dafür ist, dass die angeborene antivirale Antwort der Linie gegenüber primären CEF abgeschwächt ist. Das ist zugleich der praktische Vorteil der Linie und eine Einschränkung, die man verstanden haben muss, bevor man sie für immunologische Fragestellungen einsetzt.

Publizierte Arbeiten haben gezeigt, dass DF-1-Zellen ein konstitutiv erhöhtes Niveau des Hühner-SOCS1 aufweisen -- Suppressor of Cytokine Signalling 1, ein negativer Regulator der Zytokinsignalübertragung -- mit einer basalen Expression, die etwa 16-fach höher als in primären CEF berichtet wird, und dass dies die angeborenen Antworten in der Linie unterdrückt. Vergleichende Studien zur Expression angeborener Immungene nach Infektion mit hochpathogenem H5N1 und niedrigpathogenem H9N2 der aviären Influenza haben diese Antworten in DF-1 im Detail beschrieben.

Was daraus praktisch folgt:

• Für die Virusanzucht ist das ein Vorteil. Ein Wirt mit gedämpfter Interferonantwort erlaubt höhere Replikation und besser reproduzierbare Titer. Ein Teil des Rufs von DF-1, die Titer von CEF zu erreichen oder zu übertreffen, geht hierauf zurück und nicht auf eine im engeren Sinne bessere Permissivität.
• Für die Untersuchung der angeborenen Immunität ist es ein ernster Störfaktor. Ergebnisse zu Interferoninduktion, Zytokinsignalübertragung und antiviraler Genexpression aus DF-1 lassen sich nicht ohne Weiteres auf primäre CEF oder auf das Tier übertragen. Solche Arbeiten sollten in Primärzellen bestätigt werden, und Publikationen sollten angeben, welches System verwendet wurde und warum.
• Für Untersuchungen zur Wirt-Pathogen-Interaktion allgemein ist zusätzlich an die oben genannte veränderte Funktion von p53 und E2F-1 zu denken. DF-1 ist ein hervorragender Produktions- und Vermehrungswirt und ein eingeschränktes Modell der normalen Fibroblastenphysiologie.

Nichts davon spricht gegen den Einsatz von DF-1. Es spricht dafür, das System an die Fragestellung anzupassen -- dasselbe Argument gilt für jede immortalisierte Linie und ist für diese hier nur ungewöhnlich gut dokumentiert.

Bezug. Beziehen Sie DF-1 von einer etablierten Zellbank mit dokumentierter Herkunft und nicht aus einer undokumentierten Weitergabe von Labor zu Labor. Die Herkunft zählt hier mehr als sonst, denn die definierende Eigenschaft der Linie -- die Freiheit von endogenem Retrovirus -- ist genau das, was sich durch Betrachten der Zellen nicht überprüfen lässt.

Authentifizieren und testen. Bestätigen Sie die Identität bei Erhalt und führen Sie vor dem Einbanken einen Mykoplasmennachweis durch. Mykoplasmen verändern Virusreplikation und Titer, was bei einem Wirt für die Virusvermehrung Ihren wichtigsten Messwert unmittelbar bedroht.

Richtig einbanken. Legen Sie eine Masterbank bei niedriger Passagenzahl und daraus eine Arbeitsbank an, und arbeiten Sie aus der Arbeitsbank. Das ist für jede Linie gute Praxis, lohnt sich aber besonders für eine Linie, deren Wert in der Gleichmäßigkeit zwischen den Präparationen liegt.

Halten Sie das Passagenfenster konstant, wenn der Titer entscheidend ist, und dokumentieren Sie die Passagenzahl zusammen mit den Titerdaten.

Achten Sie auf das Medium. Glutamin zerfällt in Lösung und erzeugt Ammoniak; verwenden Sie für lange Infektionen eine frische Mediencharge oder eine stabilisierte Dipeptid-Glutaminquelle, denn dort kann sich anreicherndes Ammoniak sowohl auf die Zellen als auch auf die Virusausbeute auswirken.

Biologische Sicherheit. DF-1 selbst erfordert die üblichen Einschließungsmaßnahmen der Zellkultur. Die Sicherheitsstufe einer konkreten Arbeit wird durch das vermehrte Virus bestimmt, nicht durch die Zelllinie -- hochpathogene aviäre Influenza und andere Erreger bringen ihre eigenen, deutlich höheren Anforderungen und eigene behördliche Genehmigungen mit sich. Klären Sie die geltende Sicherheitsstufe und die Genehmigungslage, bevor Sie mit Vermehrungsarbeiten beginnen.