Essenzielle und nicht essenzielle Aminosäuren in der Zellkultur

Die Begriffe sind aus der Ernährungslehre entlehnt, doch die Liste ist eine andere, und genau daher rührt der größte Teil der Verwirrung um diese Frage.

In der Zellkultur ist eine Aminosäure praktisch dann essenziell, wenn die Zellen in Ihrer Flasche sie nicht in ausreichender Menge synthetisieren können, sie also im Medium enthalten sein muss, sonst kommt das Wachstum zum Erliegen. Harry Eagle hat diese Liste in den 1950er-Jahren experimentell erstellt, indem er Bestandteile einzeln wegließ und beobachtete, welches Fehlen die Zellen nicht überlebten.

Die für die Zellkultur essenzielle Gruppe umfasst dreizehn Aminosäuren: L-Arginin, L-Cystin, L-Glutamin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin.

Vier davon -- Arginin, Cystin, Tyrosin und Glutamin -- gelten ernährungsphysiologisch nicht als essenziell, denn ein ganzer Organismus verfügt über Gewebe und Stoffwechselwege, die einem Zellrasen in der Flasche fehlen. Kultivierten Zellen fehlt der Stoffwechsel zwischen den Organen, der sie versorgt; aus Sicht des Mediums müssen sie daher zugeführt werden. Beim Lesen älterer Literatur lohnt es sich, hier genau zu sein: Eine Arbeit, die Tyrosin als nicht essenziell bezeichnet, verwendet mit ziemlicher Sicherheit die ernährungsphysiologische und nicht die zellkulturbezogene Definition.

Ein handelsübliches 50X-Supplement essenzieller Aminosäuren für MEM (MEM EAA) enthält zwölf der dreizehn. Glutamin bleibt darin ausgespart und wird gesondert zugesetzt; die Gründe stehen weiter unten.

Die in der Zellkultur nicht essenzielle Gruppe umfasst genau sieben: Glycin, L-Alanin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, L-Prolin und L-Serin. Das ist der Inhalt jedes Produkts, das als MEM NEAA verkauft wird.

Die übliche 100X-Formulierung enthält alle sieben zu je 10 mM -- Glycin 750 mg/L, L-Alanin 890, L-Asparagin 1320, L-Asparaginsäure 1330, L-Glutaminsäure 1470, L-Prolin 1150 und L-Serin 1050. Verdünnt man 1:100, indem man 10 mL pro Liter Medium zugibt, liegt jede am Ende bei 0.1 mM Endkonzentration. Dass das Konzentrat über alle sieben glatte 10 mM aufweist, ist Absicht und macht die Rechnung trivial: 1X bedeutet immer 0.1 mM je Aminosäure.

Beachten Sie, was nicht darin ist. Ein NEAA-Supplement enthält kein Glutamin und kein Cystein. Wenn ein Protokoll die Zugabe von NEAA und Glutamin verlangt, sind das zwei getrennte Zugaben, und die eine deckt die andere nicht ab.

Das ist der berechtigte Einwand, und darauf gibt es vier Antworten.

Die Biosynthese ist nicht umsonst. Eine Aminosäure von Grund auf herzustellen, verbraucht Kohlenstoffgerüste aus dem Zentralstoffwechsel, ATP und Reduktionsäquivalente. In einer rasch wachsenden Kultur sind das dieselben Ressourcen, die für den Aufbau von Biomasse gebraucht werden. Die Aminosäure fertig anzubieten, erlaubt den Zellen, dieses Budget stattdessen ins Wachstum zu stecken, und das Ergebnis ist üblicherweise eine mäßig höhere Wachstumsrate und eine höhere erreichbare Dichte.

Manche Linien können sie tatsächlich nicht bilden. "Nicht essenziell" beschreibt die typische Säugerzelle, nicht jede Zelllinie. CHO-K1 ist durch einen Mangel an Pyrrolin-5-carboxylat-Synthase prolinauxotroph und benötigt Prolin schlicht im Medium; die Expression des fehlenden Enzyms stellt die Prolinunabhängigkeit wieder her. Das ist keine Randnotiz -- es ist der Grund, warum Ham's F-12, das für CHO-Zellen entwickelte Medium, Prolin mit 0.3 mM führt, dem Dreifachen der übrigen sechs. Ebenso hängen Linien mit geringer Aktivität der Asparaginsynthetase von exogenem Asparagin ab.

Einige von ihnen tun mehr, als Protein aufzubauen. Serin und Glycin speisen über den Folatzyklus den C1-Stoffwechsel und liefern Bausteine für die Nukleotidsynthese und für Methylierungsreaktionen. Der Serinbedarf einer proliferierenden Zelle kann über das hinausgehen, was sie bequem synthetisiert, und da beide ineinander umwandelbar sind, wird das Paar oft gemeinsam limitierend.

Vorhandensein garantiert keine Aufnahme. Insbesondere Aspartat wird von vielen Säugerzellen schlecht transportiert, sodass seine Konzentration im Medium nur ein schwacher Anhaltspunkt für seine Verfügbarkeit in der Zelle ist. Daran sollte man denken, bevor man schließt, ein aspartathaltiges Medium habe diesen Bedarf abgedeckt.

Dem gegenüber steht, dass das Supplement preiswert ist und dem Medium etwa 0.7 mOsm/kg hinzufügt, was gegenüber typischen 280-320 mOsm/kg vernachlässigbar ist. Es zuzusetzen, obwohl es nicht nötig war, kostet wenig; es wegzulassen, obwohl es nötig gewesen wäre, bedeutet eine langsame Kultur, deren Ursache Sie zwei Wochen lang suchen.

Das ist die praktische Frage, und die Antwort fällt weit unterschiedlicher aus, als die meisten erwarten. Die Vergleichstabelle weiter unten gibt die vollständige Aufschlüsselung; zusammengefasst gilt:

MEM (nach Eagle) enthält keine der sieben. Das ist so gewollt -- es ist das minimale essenzielle Medium, und das NEAA-Supplement existiert genau, um es zu ergänzen. Beachten Sie, dass eine als EMEM von der ATCC gekennzeichnete Flasche nicht essenzielle Aminosäuren durchaus enthält, ein Gibco MEM dagegen nicht; die Bezeichnung "MEM" allein sagt also nichts.

DMEM enthält zwei: Glycin und L-Serin, beide mit 0.4 mM. Die anderen fünf führt es nicht. DMEM ist deshalb ein häufiger Kandidat für eine NEAA-Zugabe, besonders bei Arbeiten mit HEK293, bei Transfektionen und bei der Virusproduktion.

RPMI 1640 enthält sechs der sieben, in voneinander abweichenden Konzentrationen -- Asparagin 0.379 mM, Serin 0.286, Prolin 0.174, Asparaginsäure 0.150, Glutaminsäure 0.136 und Glycin 0.133. L-Alanin ist nicht enthalten. Wenn Sie RPMI ergänzen, ist Alanin das einzige Mitglied der Gruppe, das wirklich fehlt.

Ham's F-12 enthält alle sieben, sechs davon mit genau 0.1 mM und Prolin mit 0.3 mM -- also derselbe Arbeitswert, den eine 1X-Zugabe von NEAA liefern würde. Eine NEAA-Zugabe zu F-12 ist normalerweise überflüssig.

IMDM enthält alle sieben, und in der Regel in höheren Mengen als F-12: Glutaminsäure 0.510 mM, Glycin und Serin 0.4, Prolin 0.348, Alanin 0.281, Asparaginsäure 0.226 und Asparagin 0.189.

DMEM/F-12 enthält alle sieben, ungefähr in der Hälfte der F-12-Konzentrationen, weil es eine 1:1-Mischung mit DMEM ist.

MEM alpha enthält sie ebenfalls, als Teil seiner Anreicherung gegenüber dem reinen MEM.

Glutamin steht auf der Liste der essenziellen Aminosäuren, verhält sich aber anders als alles andere darauf, und es ist die Aminosäure, die am ehesten Schwierigkeiten macht.

Zellen nutzen es als wichtigsten Stickstoffdonor für die Biosynthese und über die Glutaminolyse als bedeutende Kohlenstoffquelle für den Citratzyklus. Der Bedarf ist hoch -- MEM führt 2 mM und DMEM 4 mM, eine Größenordnung über den meisten anderen Aminosäuren.

Es ist zudem in wässriger Lösung chemisch instabil. Freies L-Glutamin zyklisiert spontan zu Pyrrolidoncarbonsäure und setzt dabei Ammoniak frei, und die Reaktion läuft bei 37 °C schneller als in der Kälte. Daraus folgen zwei Probleme: Das Medium verliert über seine Haltbarkeit und während der Inkubation Glutamin, und das anfallende Ammoniak wirkt auf viele Zelllinien selbst hemmend.

Drei Antworten darauf sind üblich. Kaufen Sie Medium ohne Glutamin und setzen Sie es frisch aus einer eingefrorenen 100X- oder 200X-Stammlösung zu, was das traditionelle Vorgehen ist. Verwenden Sie eine Dipeptidform -- L-Alanyl-L-Glutamin oder L-Glycyl-L-Glutamin --, die in Lösung stabil ist und von Peptidasen an der Zelloberfläche gespalten wird, sodass Glutamin nach Bedarf freigesetzt wird; das vermeidet sowohl den Verlust als auch den Ammoniakanstieg. Oder kaufen Sie ein Medium, das bereits mit dem Dipeptid formuliert ist, wovon die meisten Kataloge mehrere Produkte führen.

Für diese Seite ist der praktische Punkt schlicht, dass Glutamin nie von einem NEAA-Supplement abgedeckt wird und selten von einer alten Flasche Komplettmedium ausreichend abgedeckt ist. Wächst eine Kultur in Medium schlecht, das seit Monaten im Regal steht, gehört Glutamin zu den ersten Dingen, die zu prüfen sind.

NEAA zugeben. Geben Sie 10 mL eines 100X-Supplements pro Liter Medium zu, was 0.1 mM je der sieben Aminosäuren ergibt. Geben Sie es einmalig zum Komplettmedium, zum selben Zeitpunkt wie Serum und Glutamin, und dokumentieren Sie es als Teil der Formulierung und nicht als gelegentlichen Zusatz -- eine uneinheitliche Ergänzung zwischen den Ansätzen ist eine häufige und vollständig vermeidbare Quelle von Schwankungen.

Medien, die meist profitieren: MEM und DMEM, die keine oder nur zwei der sieben enthalten. Eine NEAA-Zugabe zu DMEM ist Routine bei der Kultur humaner pluripotenter Stammzellen, bei HEK293-basierten Transfektionen und der Virusproduktion, bei Hybridomarbeiten und bei mesenchymalen Stromazellen.

Medien, bei denen sie meist überflüssig ist: Ham's F-12, IMDM und DMEM/F-12 führen bereits alle sieben in Arbeitskonzentration. Mehr zuzugeben ist in dieser Größenordnung nicht schädlich, bringt aber auch nichts und macht Ihre Formulierung schwerer reproduzierbar.

RPMI 1640 ist der interessante Zwischenfall -- es hat sechs der sieben und es fehlt nur Alanin, sodass eine vollständige NEAA-Zugabe überwiegend auffüllt, was ohnehin schon da ist.

Betrachten Sie NEAA nicht als Rettung für eine schwächelnde Kultur. Wachsen Zellen schlecht, sind Kontamination, Glutaminzerfall, Serumcharge, pH-Wert und Mykoplasmen allesamt wahrscheinlichere Erklärungen, und Aminosäuren in ein ohnehin ausreichendes Medium zu geben, hilft nicht. Ändern Sie immer nur eine Variable auf einmal.

Verwechseln Sie die beiden Supplemente nicht. MEM NEAA 100X liefert die sieben mit je 0.1 mM. Das 50X-Supplement essenzieller Aminosäuren (MEM EAA) liefert die zwölf essenziellen Aminosäuren außer Glutamin und dient dazu, Medien anzureichern oder wiederherzustellen, nicht dazu, routinemäßig einer fertigen Formulierung zugesetzt zu werden. Sie sind nicht austauschbar, und die Konzentrate haben unterschiedliche Stärken.