Puffer in der Zellkultur

Die meisten Säugerzellen wachsen am besten zwischen pH 7.2 und 7.4, und das tolerierbare Fenster ist schmaler, als allgemein angenommen wird. Die berichteten Optima unterscheiden sich je nach Zelltyp - transformierte Linien werden häufig im unteren Teil des Bereichs beschrieben, um pH 7.0-7.4, normale Fibroblasten im oberen Teil, um 7.4-7.7 -, doch in jedem Fall ist das Arbeitsfenster nur wenige Zehntel einer pH-Einheit breit.

Dieses Fenster zu halten ist keine passive Angelegenheit. Zellen säuern ihr Medium fortlaufend an: Die Glykolyse erzeugt Lactat, die Atmung erzeugt Kohlendioxid. In einer dichten Kultur ist die Säurelast erheblich, weshalb eine überkonfluente Flasche innerhalb eines Tages gelb wird. Aufgabe eines Puffers ist es, diese Last aufzunehmen, ohne dass der pH-Wert vor der nächsten Fütterung aus dem Fenster wandert.

Ein Puffer wirkt einer pH-Änderung am wirksamsten innerhalb von etwa einer pH-Einheit beiderseits seines eigenen pKa entgegen, ein Puffer für die Zellkultur braucht also einen pKa nahe 7.4. Diese eine Anforderung scheidet die meisten Laborpuffer sofort aus. Was übrig bleibt, muss mehrere weitere Bedingungen erfüllen: Der Puffer darf die Plasmamembran nicht durchdringen und das Cytoplasma puffern, er darf das in der Formulierung enthaltene Calcium, Magnesium, Zink und Eisen nicht komplexieren, er darf kein Licht so absorbieren, dass Assays gestört werden, er muss in Lösung stabil und in Arbeitskonzentration untoxisch sein, und er muss im Litermaßstab bezahlbar bleiben.

Tris zeigt anschaulich, was passiert, wenn diese Bedingungen nicht erfüllt sind. Es hat einen pKa von 8.06 bei 25 Grad C, der bereits zu hoch liegt, einen Temperaturkoeffizienten von -0.028 pH-Einheiten pro Grad C, also etwa das Doppelte von HEPES, und eine so hohe Lipidlöslichkeit, dass es Membranen durchdringt - genau deshalb ist es für viele Säugerzellen toxisch und wird trotz seiner Allgegenwart in der Biochemie nicht für die Zellkultur verwendet.

Es gibt eine zweite Vorgabe, die leicht vergessen wird: die Osmolalität. Ein Puffer, der den pH-Wert einstellt, dabei aber die Gesamtosmolalität aus dem für Säugerzellen tolerierbaren Bereich von 260-320 mOsmol/kg schiebt, hat das Problem nicht gelöst. Pufferwahl und Osmolalität sind ein und dieselbe Frage.

Der Standardpuffer klassischer Medien ist Natriumbicarbonat im Zusammenspiel mit gasförmigem CO2, und dafür gibt es gute Gründe: Es ist der physiologische Puffer, es ist günstig, und Bicarbonat ist zugleich ein Nährstoff, den die Zellen in Carboxylierungsreaktionen verbrauchen.

Die Chemie ist ein gekoppeltes Gleichgewicht. Kohlendioxid löst sich im Medium und hydratisiert zu Kohlensäure, die in Bicarbonat und ein Proton dissoziiert. Der scheinbare pKa des Kohlensäuresystems liegt unter physiologischen Bedingungen bei 6.1, und der resultierende pH-Wert wird durch die Henderson-Hasselbalch-Beziehung beschrieben:

pH = 6.1 + log( [HCO3-] / (0.03 x pCO2) )

wobei pCO2 in mmHg angegeben wird und 0.03 der Löslichkeitskoeffizient für CO2 in mmol/L pro mmHg ist.

Die wichtige Folgerung lautet: Der pH-Wert wird durch das Verhältnis von Bicarbonat zu gelöstem CO2 bestimmt, nicht durch eines von beiden allein. Weder das Natriumbicarbonat in der Formulierung noch das CO2 im Inkubator legt den pH-Wert für sich fest. Sie legen ihn gemeinsam fest, und deshalb müssen sie gemeinsam angegeben werden.

Das erklärt zugleich die zentrale Schwäche des Systems. CO2 ist flüchtig. Raumluft enthält etwa 0.04% CO2 gegenüber 5% oder 10% im Inkubator; sobald eine Flasche herausgenommen wird, verlässt gelöstes CO2 das Medium, während das Bicarbonat zurückbleibt. Das Verhältnis steigt, und mit ihm der pH-Wert. Unter einer Sterilbank kann ein bicarbonatgepuffertes Medium innerhalb von zehn bis zwanzig Minuten sichtbar ins Alkalische driften.

Ein dritter Punkt: Bicarbonatlösungen sind an der offenen Luft chemisch instabil. Natriumbicarbonat wird spät bei der Medienherstellung zugegeben, und Pulvermedien werden üblicherweise ohne Bicarbonat geliefert, gerade damit es frisch zugesetzt werden kann.

Dies ist der häufigste Konfigurationsfehler in der Zellkultur, und die Rechnung, die ihn vermeidet, lohnt sich einmal.

Nehmen wir einen Inkubator mit 5% CO2 auf Meereshöhe. Korrigiert man um den Wasserdampf bei 37 Grad C, beträgt pCO2 etwa 0.05 x (760 - 47) = 36 mmHg, gelöstes CO2 also etwa 0.03 x 36 = 1.1 mmol/L. Für einen Ziel-pH-Wert von 7.4 gilt:

log([HCO3-] / 1.1) = 7.4 - 6.1 = 1.3, also [HCO3-] = 1.1 x 20 = 22 mmol/L, das entspricht 1.8 g/L Natriumbicarbonat (M 84.01).

Wiederholt man das bei 10% CO2, verdoppelt sich das gelöste CO2 auf 2.1 mmol/L und es werden etwa 43 mmol/L Bicarbonat benötigt - 3.6 g/L.

Diese Zahlen sind kein Zufall. Sie sind der Grund, warum Standard-DMEM mit 3.7 g/L Natriumbicarbonat formuliert und für einen Inkubator mit 10% CO2 ausgelegt ist und warum Formulierungen mit 1.5-2.2 g/L für 5% CO2 ausgelegt sind. RPMI 1640 mit 2.0 g/L ist ein Medium für 5% CO2.

Medium / Lösung	NaHCO3	ca. mM	Vorgesehene Atmosphäre
DMEM (Standard)	3.7 g/L	44	10% CO2
DMEM (Varianten für 5% CO2)	1.5-2.2 g/L	18-26	5% CO2
RPMI 1640	2.0 g/L	24	5% CO2
EBSS (Earle's)	2.2 g/L	26	5% CO2
HBSS (Hank's)	~0.35 g/L	~4	Umgebungsluft
DPBS / PBS	keines	0	Umgebungsluft (phosphatgepuffert)

Betreibt man eine Formulierung mit 3.7 g/L bei 5% CO2, bleibt das Medium dauerhaft alkalisch - es driftet typischerweise Richtung pH 7.6-7.8, was Zellen schlecht vertragen und was sich als hartnäckig rosa-violettes Medium zeigt, das selbst in einer dichten Kultur nie gelb wird. Umgekehrt führt ein bicarbonatarmes Medium bei 10% CO2 zu dauerhafter Azidose.

Auch die Höhenlage spielt eine Rolle und wird tatsächlich oft übersehen. Die obige Rechnung setzt 760 mmHg an. Auf 1500 m beträgt der Luftdruck rund 630 mmHg, dieselbe Einstellung von 5% CO2 liefert also etwa 17% weniger gelöstes CO2, und das Medium liegt höher im pH-Wert. Laboratorien in Höhenlagen betreiben ihre Inkubatoren üblicherweise mit einem höheren CO2-Anteil, um das auszugleichen.

Die von Norman Good und Mitarbeitern beschriebenen zwitterionischen Puffer wurden genau nach den Kriterien ausgewählt, die am Anfang dieser Seite stehen, und sie sind die Antwort auf das Flüchtigkeitsproblem des Bicarbonatsystems.

HEPES ist derjenige, dem Sie begegnen werden. pKa 7.48 bei 25 Grad C, nutzbarer Bereich etwa pH 6.8-8.2, Arbeitskonzentration 10-25 mM in der Kultur. Da keine Seite seines Säure/Base-Paares gasförmig ist, wird seine Pufferkapazität allein durch die zugesetzte Menge bestimmt und bleibt von der Atmosphäre unbeeinflusst. Das macht ihn zum Standardzusatz für die Lebendzellmikroskopie ohne Gasregelung, für die Zellsortierung, für die Gewebedissoziation auf der Bank, für den Transport lebender Kulturen und für jedes Protokoll mit langen Handhabungsschritten.

Drei Vorbehalte gelten. HEPES reagiert unter sichtbarem Licht photochemisch mit dem Riboflavin des Mediums zu Wasserstoffperoxid, HEPES-haltige Medien müssen daher dunkel gelagert und gehandhabt werden. Oberhalb des Arbeitsbereichs ist HEPES zytotoxisch. Und er ist ausschließlich ein Puffer - er trägt nichts zur Ernährung bei und ergänzt das Bicarbonat, statt es zu ersetzen.

MOPS hat einen pKa von 7.20 und puffert nutzbar von etwa pH 6.5 bis 7.9. Er taucht in Spezial- und Mikrobenformulierungen sowie in Teilen der Elektrophorese- und Proteinarbeit auf, hat HEPES in der Säugerzellkultur aber nicht verdrängt.

Weitere Mitglieder der Familie - TES, BES, PIPES, TAPS - liegen an verschiedenen Punkten über den physiologischen Bereich verteilt und werden in biochemischen Arbeiten gewählt, wenn ein bestimmter pKa gebraucht wird. In Wachstumsmedien werden sie selten eingesetzt.

Die allgemeine Regel für organische Puffer in der Kultur lautet, dass sie Ergänzungen sind, kein Ersatz. Nimmt man das Bicarbonat heraus und setzt allein auf HEPES, wächst eine Vielzahl von Linien langsamer oder gar nicht mehr, denn Bicarbonat ist ebenso Substrat wie Puffer. Die Standardkonfiguration ist Bicarbonat passend zum Inkubator, ergänzt um einen organischen Puffer, wenn die Arbeit es verlangt.

Phosphat ist ein echter physiologischer Puffer mit einem günstigen pKa. Die maßgebliche Dissoziation, Dihydrogenphosphat zu Hydrogenphosphat, hat einen pKa von 7.20, womit der physiologische Bereich genau in ihrem nutzbaren Fenster liegt.

Der Gesamtphosphatgehalt unterscheidet sich zwischen den beiden Flaschen, die in jedem Regal nebeneinanderstehen, stärker, als die meisten erwarten. Ein Standard-PBS bei pH 7.4 enthält etwa 4.0 mM Gesamtphosphat, die Formulierung nach Dulbecco (DPBS) dagegen etwa 9.5 mM - deutlich mehr als das Doppelte. DPBS hält den pH-Wert daher erheblich besser, wenn Zellen, ein saures Reagenz oder ein Schwall Medium hinzukommen, was ein praktischer Grund ist, es für alles jenseits einer kurzen Spülung vorzuziehen.

Calcium- und Magnesiumkonzentrationen der Varianten, die sie enthalten:

Lösung	Calcium (Ca2+)	Magnesium (Mg2+)	Gesamtphosphat
PBS pH 7.4	keines	keines	~4.0 mM
DPBS, ohne Ca/Mg	keines	keines	~9.5 mM
DPBS, mit Ca/Mg	0.90 mM (CaCl2 100 mg/L)	0.49 mM (MgCl2.6H2O 100 mg/L)	~9.5 mM
HBSS, mit Ca/Mg	1.26 mM (CaCl2 140 mg/L)	0.90 mM (MgCl2.6H2O 100 + MgSO4.7H2O 100 mg/L)	~0.78 mM

Wozu die zweiwertigen Kationen tatsächlich da sind. Sie puffern nichts - sie halten Zellen angeheftet. Integrine brauchen an ihrer metallionenabhängigen Adhäsionsstelle ein zweiwertiges Kation, um Matrix zu binden, und Cadherine brauchen Calcium, um die starre extrazelluläre Konformation zu halten, die ihre gegenseitige Bindung erlaubt. Ein calciumhaltiger Waschschritt hält einen Monolayer angeheftet und die Zell-Zell-Kontakte intakt; ein calciumfreier Waschschritt beginnt beides in dem Moment zu lockern, in dem er zugegeben wird. Calcium und Magnesium werden außerdem von den Metalloprotease-Dissoziationsenzymen Dispase und Kollagenase benötigt, weshalb diese in einer Ca/Mg-haltigen Lösung verdünnt werden.

Eine Folge ist wissenswert: Calcium- und Magnesiumphosphate sind nur begrenzt löslich, calciumhaltige Phosphatsalzlösungen neigen daher in 10X-Konzentraten und beim Autoklavieren zum Ausfallen. Die Sterilfiltration bei 0.22 Mikrometer ist für jede calciumhaltige Phosphatsalzlösung der sicherere Weg.

Phosphatgepufferte Lösungen sind die Arbeitspferde der Handhabung: Waschen von Monolayern vor der Trypsinierung, Verdünnen von Reagenzien, Spülen, kurzer Transport und Resuspendieren von Zellen für die Zellzählung. Sie sind einfach, stabil, preiswert und brauchen kein Inkubatorgas.

Sie sind keine Wachstumsmedien, und die Gründe dafür sollte man klar benennen.

Phosphat hat gegenüber einer echten metabolischen Säurelast nur begrenzte Pufferkapazität. Es liefert keinen Kohlenstoff, keine Aminosäuren, keine Vitamine und in den meisten Formulierungen keine Glucose. Phosphat fällt in höheren Konzentrationen mit Calcium als Calciumphosphat aus, weshalb die calcium- und magnesiumhaltigen Formulierungen als eigene Produkte neben den Ca/Mg-freien existieren und weshalb man den Phosphatgehalt nicht beiläufig erhöhen sollte. Und bicarbonatfreie Lösungen entziehen den Zellen ein Substrat, das sie brauchen.

Die Unterscheidung zwischen Calcium/Magnesium-haltig und -frei ist die, an der es hakt. Ca/Mg-freies DPBS ist der richtige Waschschritt vor der Trypsinierung, denn zweiwertige Kationen sind genau das, was das EDTA in Trypsin-EDTA entfernen soll - unmittelbar vorher mit einer calciumhaltigen Formulierung zu waschen, arbeitet gegen das Dissoziationsreagenz. Ca/Mg-haltiges DPBS ist das richtige Verdünnungsmittel, wenn Adhäsion und kationenabhängige Enzymaktivität erhalten bleiben sollen, wozu das Verdünnen von Dispase und Kollagenase gehört, beides calciumabhängige Metalloproteasen.

Für Handhabungsschritte, die etwas mehr Unterstützung brauchen als PBS - kurzfristiges Halten von Gewebe, kurze Inkubationen, Dissoziationspuffer -, ist eine ausgewogene Salzlösung wie HBSS oder EBSS die bessere Wahl, weil sie neben den Salzen Glucose und einen niedrigen Bicarbonatgehalt mitbringt.

Phenolrot ist kein Puffer. Es ist ein pH-Indikator, der den meisten Medien mit etwa 15 mg/L zugesetzt wird, damit der Zustand einer Kultur auf einen Blick erkennbar ist.

Seine Farbumschläge sind:

• Gelb unterhalb von etwa pH 6.8 - das Medium ist sauer. In einer Kultur bedeutet das normalerweise hohe Zelldichte mit Lactatanreicherung oder eine bakterielle Kontamination; beides erfordert sofortiges Handeln und nicht erst zur nächsten geplanten Fütterung.
• Orange bis Rot über pH 7.0-7.4 - der Arbeitsbereich. Eine gesunde Kultur ist rot und geht ins Orange über, wenn sie dichter wird.
• Rosa bis Violett oberhalb von etwa pH 8.2 - das Medium ist alkalisch. Die üblichen Ursachen sind ein Missverhältnis zwischen Bicarbonat und CO2, ein Inkubator ohne CO2-Versorgung, eine offen stehen gelassene Tür oder eine Flasche, die schlicht zu lange auf der Bank stand.

Zwei Einschränkungen sind wichtig. Erstens ist Phenolrot ein grobes Instrument: Es zeigt Ihnen ein Problem von mehreren Zehntel pH-Einheiten, aber es unterscheidet pH 7.2 nicht von 7.4, und die Farbbeurteilung mit dem Auge ist bei unterschiedlicher Beleuchtung subjektiv. Ist der pH-Wert eine experimentelle Variable, messen Sie ihn.

Zweitens ist Phenolrot biologisch nicht inert. Es hat eine schwache östrogene Wirkung und kann Östrogenrezeptoren binden, was in hormonempfindlichen Systemen - besonders bei Brustkrebslinien - ein echter Störfaktor ist. Es fluoresziert außerdem und absorbiert in Bereichen, die fluoreszenzbasierte Assays und Absorptionsmessungen stören. Deshalb gibt es von praktisch jedem Medium und jedem Reagenz phenolrotfreie Versionen: Sie sind für Hormonarbeiten, Mikroskopie und Plattenlesegerät-Assays gedacht, und sich für eine solche Version zu entscheiden heißt bewusst, die visuelle pH-Anzeige gegen einen saubereren Hintergrund einzutauschen.

Ein Puffer ist nur so gut wie die Flasche, aus der er kommt, und konzentrierte Stammlösungen sind die Stelle, an der die meiste vermeidbare Streuung in ein Labor gelangt. Einige Regeln gelten über das ganze Regal hinweg.

Aliquotieren Sie alles, was Sie wiederholt verwenden. Jede Rückkehr zur Vorratsflasche ist eine Gelegenheit, sie zu kontaminieren, und bei allem Enzymatischen kostet jeder Einfrier-Auftau-Zyklus Aktivität. Teilen Sie bei Wareneingang in Volumina auf, die Ihrer tatsächlichen Arbeitsweise entsprechen.

Filtrieren statt autoklavieren, wenn etwas hitzeempfindlich ist. Das betrifft mehr Reagenzien, als man annimmt: Enzyme werden vollständig zerstört, Glucose und andere reduzierende Zucker bräunen in Gegenwart von Aminogruppen, calciumhaltige Phosphatsalzlösungen fallen aus, und HEPES-Lösungen verfärben sich. Die Sterilfiltration bei 0.22 Mikrometer ist der Standard für Zellkultur-Stammlösungen.

Schützen Sie lichtempfindliche Stammlösungen vor Licht. HEPES ist im Pufferkontext der wichtige Fall, weil es photochemisch mit Riboflavin Wasserstoffperoxid bildet, doch der Hinweis steht auf vielen Reagenzetiketten und sollte befolgt und nicht wegdiskutiert werden.

Notieren Sie das Datum, an dem die Flasche geöffnet oder aufgetaut wurde, nicht nur das auf dem Etikett aufgedruckte Verfallsdatum. Die meisten Reagenzprobleme sind Probleme der Nutzungsdauer.

IPTG ist ein nützliches Rechenbeispiel, weil es anders gelagert wird als fast alles andere auf dieser Seite und weil dieser Unterschied zählt. Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranosid hat eine Molmasse von 238.30, eine 1-M-Stammlösung entspricht also 238.3 g/L - in der Praxis 2.38 g, in Wasser gelöst und auf 10 mL aufgefüllt. Es löst sich rasch in Wasser und braucht keine Wärme.

1. In Wasser in Zellkulturqualität oder in deionisiertem Wasser lösen und auf Volumen auffüllen.
2. Durch eine 0.22-Mikrometer-Membran sterilfiltrieren. IPTG niemals autoklavieren - Hitze zersetzt es.
3. In kleine Einmalvolumina aliquotieren, üblicherweise 0.5 oder 1.0 mL.
4. Bei -20 Grad C lagern, dort hält sich die Stammlösung bis zu einem Jahr. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden; genau dafür sind die kleinen Aliquots da.

Die Arbeitskonzentrationen liegen typischerweise bei 0.1-1 mM. Die Zugabe von 1 mL einer 1-M-Stammlösung zu einer 1-L-Kultur ergibt eine Endkonzentration von 1 mM. Für das Blau-Weiß-Screening ist eine 100-mM-Stammlösung die praktischere Stärke. Der allgemeine Punkt geht über IPTG hinaus: Prüfen Sie bei jeder Stammlösung eines Kleinmoleküls, ob Hitze, Licht oder Einfrier-Auftau-Zyklen der zersetzende Faktor sind, und lagern Sie entsprechend, statt alles vorbehaltlos in den Kühlschrank zu stellen.

Osmolalität. Säugerzellen tolerieren etwa 260-320 mOsmol/kg, und Pufferentscheidungen verschieben diesen Wert. Der Zusatz von HEPES zu einem vollständigen Medium erhöht die Osmolalität, weil eine 1-M-Stammlösung weit konzentrierter ist als das Medium, das sie aufnimmt; Medien, die von vornherein mit HEPES formuliert sind, gleichen das durch weniger Natriumchlorid aus, selbst ergänzte Medien nicht. Wiederholtes Zufüttern mit konzentrierten Supplementen über einen langen Fed-Batch-Lauf lässt die Osmolalität stetig ansteigen. Basenzugabe gegen die Lactatansäuerung bringt Natrium ein. Keiner dieser Beiträge ist für sich groß; zusammen, über einen zweiwöchigen Lauf, sind sie es. Fällt die Viabilität spät in einer Kultur, die ernährungsphysiologisch ausreichend versorgt aussieht, messen Sie die Osmolalität, bevor Sie nach Exotischerem suchen.

Eine kurze Diagnosefolge für pH-Probleme:

1. Das Medium bleibt violett oder rosa und wird selbst in einer dichten Kultur nie gelb. Missverhältnis zwischen Bicarbonat und CO2 - meist eine Formulierung mit 3.7 g/L in einem Inkubator mit 5% CO2. Vergleichen Sie die Spezifikation des Mediums mit der Einstellung des Inkubators. Prüfen Sie außerdem, ob die CO2-Versorgung des Inkubators nicht leer ist und ob sein Sensor kalibriert ist.
2. Das Medium wird innerhalb eines Tages nach dem Fütterung gelb. Entweder ist die Kultur zu dicht und sollte passagiert werden, oder sie ist kontaminiert. Bakterielle Kontamination säuert schnell an und geht meist mit Trübung einher.
3. Das Medium wird nur in den äußeren Vertiefungen einer Platte gelb. Verdunstung konzentriert das Medium auf. Verwenden Sie einen befeuchteten Inkubator und erwägen Sie ein Plattenlayout, das die Randvertiefungen bewusst opfert.
4. Der pH-Wert driftet während einer Arbeit auf der Bank ins Alkalische. Das ist für ein rein bicarbonatgepuffertes Medium normales Verhalten. Setzen Sie für diesen Schritt 10-25 mM HEPES zu oder verwenden Sie eine HEPES-haltige Formulierung.
5. Der pH-Wert stimmt bei Raumtemperatur, aber nicht bei 37 Grad C. Der pKa eines Puffers ist temperaturabhängig; HEPES verschiebt sich um etwa -0.014 pH-Einheiten pro Grad C. Titrieren und prüfen Sie bei Arbeitstemperatur.
6. Der pH-Wert stimmt, aber die Zellen sehen gestresst aus. Messen Sie die Osmolalität. pH-Wert und Osmolalität sind getrennte Vorgaben, und ein Medium kann bei der einen richtig und bei der anderen falsch liegen.