Einfriermedium für Zellen und Protokolle zur Kryokonservierung

Einfrieren tötet Zellen auf zwei verschiedene Weisen, und die Kryokonservierung ist ein Kompromiss zwischen beiden.

Intrazelluläres Eis. Wird zu schnell abgekühlt, hat das Wasser im Inneren der Zelle keine Zeit, sie zu verlassen, bevor es gefriert. Im Cytoplasma bilden sich Eiskristalle, und die wachsenden Kristalle zerschneiden Membranen und Organellen mechanisch. Das ist praktisch immer tödlich.

Lösungseffekte. Wird zu langsam abgekühlt, gefriert zuerst das extrazelluläre Wasser, und die verbleibende ungefrorene Lösung wird immer konzentrierter. Die Zelle verliert osmotisch Wasser an diese konzentrierte Lösung und schrumpft, und sie ist über einen längeren Zeitraum sehr hohen Konzentrationen gelöster Stoffe, extremen pH-Werten und veränderter Ionenstärke ausgesetzt. Auch das schädigt.

Zwischen beidem liegt eine optimale Abkühlrate, und sie hängt vom Zelltyp ab - eine Funktion davon, wie durchlässig die Membran für Wasser ist und wie groß die Oberfläche der Zelle im Verhältnis zu ihrem Volumen ausfällt. Für die meisten Säugerzellen liegt dieses Optimum nahe bei 1 C pro Minute, weshalb diese Zahl in nahezu jedem Protokoll auftaucht.

Was ein Kryoprotektivum bewirkt. Ein permeierendes Kryoprotektivum wie DMSO oder Glycerin dringt in die Zelle ein, senkt den Gefrierpunkt, verringert den Anteil des Wassers, der bei einer gegebenen Temperatur zu Eis wird, und dämpft den Anstieg der Konzentration gelöster Stoffe im Verlauf des Gefrierens. Es weitet das Fenster zwischen den beiden tödlichen Mechanismen, sodass eine praktikable Abkühlrate überlebbar wird. Es verhindert das Gefrieren nicht; es verändert, was das Gefrieren anrichtet.

Nicht permeierende Kryoprotektiva wie Trehalose, Saccharose und verschiedene Polymere wirken außerhalb der Zelle, steuern die Struktur des extrazellulären Eises und entwässern die Zelle allmählicher und kontrollierter. Moderne definierte Formulierungen kombinieren häufig beide Klassen.

Die klassischen Formulierungen, die alle weiterhin breit verwendet werden:

• 90% fetales Rinderserum + 10% DMSO. Die traditionelle Wahl und für viele etablierte adhärente Linien nach wie vor die robusteste. Die Serumproteine bieten zusätzlichen Schutz vor osmotischem und mechanischem Stress während der Übergänge.
• Vollständiges Wachstumsmedium + 10% DMSO. Einfacher und günstiger und für viele Linien ausreichend. Die Erholung nach dem Auftauen fällt oft etwas geringer aus als bei serumreichen Formulierungen.
• 50% vollständiges Medium + 40% FBS + 10% DMSO. Ein verbreiteter Mittelweg.
• Konditioniertes Medium plus frisches Medium plus DMSO, verwendet für Insektenzellen und einige Suspensionszellen, bei denen zellkonditioniertes Medium die Erholung verbessert.

DMSO-Konzentration: 5-10%. Zehn Prozent sind der Standardausgangspunkt und funktionieren für die Mehrzahl der Säugerzelllinien. Fünf Prozent sind häufig ebenso wirksam und weniger toxisch und lohnen einen Test für jede Linie, die Sie routinemäßig einfrieren - besonders für empfindliche Primärzellen, Stammzellen und Zellen, die direkt in einen empfindlichen Assay aufgetaut werden. Konzentrationen über 10% bringen selten einen Vorteil und erhöhen die Toxizität. Konzentrationen unter etwa 5% bieten Säugerzellen in der Regel nur unzureichenden Schutz.

Glycerin wird mit 5-10% als alternatives permeierendes Kryoprotektivum eingesetzt. Es dringt langsamer in Zellen ein als DMSO und erfordert daher eine längere Äquilibrierung, ist bei Raumtemperatur aber weniger toxisch und hat nicht die differenzierungsauslösende Wirkung von DMSO. Es ist das Standard-Kryoprotektivum für Bakterien und Hefen und eine ernsthafte Option für Säugerzellen, die schlecht auf DMSO ansprechen. Es ist kein direkter Ersatz - testen Sie es, bevor Sie eine wertvolle Linie umstellen.

Zelldichte. Frieren Sie bei 1 x 10^6 bis 1 x 10^7 Zellen/mL ein, wobei 1-5 x 10^6 Zellen/mL für Routinelinien typisch sind. Zu dünnes Einfrieren führt zu schlechter Erholung, denn Zellen erholen sich besser aus einem angemessen dichten Inokulum. Ein Standardröhrchen fasst 1-1.8 mL.

Die Qualität der Ausgangskultur zählt mehr als die Formulierung. Die Zellen sollten sich vor dem Einfrieren in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, gesund sein und eine Viabilität über 90% aufweisen. Eine Kultur, die konfluent, überwachsen, kürzlich gestresst oder bereits im Abstieg ist, friert schlecht ein, gleich welches Medium Sie verwenden. Das ist der mit Abstand größte Einflussfaktor auf die Erholung nach dem Auftauen und derjenige, der am häufigsten vernachlässigt wird.

Setzen Sie das Einfriermedium frisch an und halten Sie es kalt. DMSO entwickelt beim Mischen mit wässrigen Lösungen Wärme; setzen Sie es daher im Voraus an und kühlen Sie auf 2-8 C, bevor Sie die Zellen zugeben.

Arbeiten Sie zügig, sobald DMSO zugegeben ist - es ist für Zellen bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunkts toxisch, und die Kontaktzeit bei Raumtemperatur sollte so kurz wie möglich sein.

Vorbereitung

1. Setzen Sie das Einfriermedium im Voraus an und kühlen Sie es auf 2-8 C. Beschriften Sie die Kryoröhrchen vor Beginn mit Zelllinie, Passagenzahl, Datum, Zellzahl und Bearbeiter; auf bereits bereifte Röhrchen zu schreiben ist unzuverlässig.
2. Vergewissern Sie sich, dass die Kultur gesund ist, sich in der logarithmischen Phase befindet, nicht konfluent ist und in der Trypanblau-Zählung über 90% Viabilität liegt.

Ernte

3. Ernten Sie adhärente Zellen mit Trypsin-EDTA, mit der kleinsten nötigen Einwirkzeit, und neutralisieren Sie umgehend. Übertrypsinierte Zellen frieren schlecht ein.
4. Zentrifugieren Sie schonend - typischerweise 200-300 x g für 5 Minuten - und entfernen Sie den Überstand vollständig.
5. Zählen Sie und bestimmen Sie die Viabilität. Halten Sie die Zellzahl vor dem Einfrieren fest; Sie werden sie brauchen, um die Erholung nach dem Auftauen zu beurteilen.

Resuspendieren und abfüllen

6. Resuspendieren Sie das Pellet in kaltem Einfriermedium bei 1-5 x 10^6 Zellen/mL. Resuspendieren Sie schonend und vollständig und vermeiden Sie Blasen.
7. Füllen Sie 1-1.8 mL pro Kryoröhrchen ab und mischen Sie die Suspension zwischendurch, damit die späteren Röhrchen dieselbe Dichte enthalten wie die ersten. Zellen setzen sich schnell ab.
8. Manche Protokolle sehen eine kurze Äquilibrierung von etwa 10-15 Minuten vor, damit das DMSO eindringen kann; andere gehen direkt zum Abkühlen über. Beides ist vertretbar, doch lassen Sie Zellen nicht über längere Zeit in DMSO bei Raumtemperatur stehen.

Mit definierter Rate abkühlen

9. Überführen Sie die Röhrchen in einen Einfrierbehälter mit definierter Abkühlrate - mit Isopropanolmantel oder als konstruktiv passiver Kühler - und stellen Sie ihn in einen -80-C-Gefrierschrank. Diese liefern etwa -1 C pro Minute, was den meisten Säugerzellen entspricht.
10. Über Nacht stehen lassen, mindestens jedoch etwa 4 Stunden.
11. Für hochwertiges Material, Arbeiten zur Zelltherapie oder Zellen mit ungewöhnlichen Optimalraten verwenden Sie einen programmierbaren Einfrierautomaten mit definierter Rate, der ein reproduzierbares, dokumentiertes Profil liefert und einen gesteuerten Eiskeimbildungsschritt einsetzen kann.

In die Langzeitlagerung überführen

12. Überführen Sie die Röhrchen zügig in die Gasphase über flüssigem Stickstoff - innerhalb von 24-72 Stunden. Belassen Sie sie nicht als Langzeitlagerung im -80-C-Gefrierschrank.
13. Erfassen Sie den genauen Lagerort im Bestandsverzeichnis im Moment der Einlagerung.

Überprüfen

14. Tauen Sie nach 24-48 Stunden ein Röhrchen auf und prüfen Sie Viabilität und Erholung. Eine Bank, die nie geprüft wurde, ist keine Bank. Tun Sie das, bevor Sie die Ausgangskultur verwerfen.

Die Langzeitlagerung erfordert Temperaturen unterhalb von etwa -135 C. Das ist die Glasübergangstemperatur der verbliebenen wässrigen Phase. Oberhalb davon behalten Wassermoleküle genug Beweglichkeit, damit Eis langsam rekristallisieren kann - kleine Kristalle wachsen mit der Zeit zu größeren zusammen, und die wachsenden Kristalle schädigen die Zellen. Unterhalb davon ist die Lösung faktisch ein Glas, die molekulare Bewegung kommt im Wesentlichen zum Stillstand, und Zellen können unbegrenzt gelagert werden.

Ein -80-C-Gefrierschrank liegt oberhalb dieser Schwelle. Bei -80 C gelagerte Zellen verlieren fortlaufend an Viabilität - über Wochen bis wenige Monate meist noch hinnehmbar, darüber hinaus unzuverlässig. -80 C als Langzeitlagerung zu nutzen ist ein verbreiteter und teurer Fehler: Der Verlust verläuft lautlos und wird erst bemerkt, wenn Jahre später ein unersetzliches Röhrchen nicht mehr anwächst.

Die Lagerung in flüssigem Stickstoff bietet -196 C in der Flüssigphase und typischerweise -150 C bis -190 C in der Gasphase, beides bequem unterhalb der Schwelle.

Die Gasphase ist der Flüssigphase vorzuziehen, aus zwei Gründen. Erstens kann flüssiger Stickstoff in unvollständig dichte Kryoröhrchen eindringen; beim Erwärmen dehnt sich der eingeschlossene Stickstoff heftig aus, und Röhrchen können bersten, was beim Herausnehmen eines Racks eine echte Verletzungsgefahr darstellt. Zweitens kann flüssiger Stickstoff Kontaminationen zwischen Röhrchen übertragen, und dokumentierte Fälle von Kreuzkontamination bei Lagerung in der Flüssigphase existieren. Die Gasphase vermeidet beides. Wenn Sie doch die Flüssigphase nutzen, verwenden Sie dafür zugelassene Röhrchen oder umhüllen Sie sie zusätzlich.

Praktische Disziplin bei der Lagerung:

• Teilen Sie die Bank auf zwei Behälter auf, idealerweise in verschiedenen Räumen oder an verschiedenen Alarmkreisen. Ein einzelner Geräteausfall darf niemals eine Linie vernichten können.
• Überwachen und alarmieren Sie Stickstoffstand und Temperatur, mit einem Eskalationsweg außerhalb der Arbeitszeit, an dem eine reale Person abnimmt.
• Führen Sie ein schriftliches Bestandsverzeichnis, das von jedem einzelnen Rechner unabhängig ist, und aktualisieren Sie es zum Zeitpunkt der Einlagerung statt später.
• Halten Sie die Zeit außerhalb der Lagerung kurz. Arbeiten Sie beim Entnehmen von Röhrchen zügig und halten Sie die Racks unterhalb des Behälterhalses. Wiederholtes kurzes Erwärmen benachbarter Röhrchen schädigt sie.
• Tragen Sie Gesichtsschutz und Kryohandschuhe, wenn Sie gelagerte Röhrchen handhaben.
• Legen Sie die Bank zweistufig an - eine Master-Zellbank mit niedriger Passage, die selten angerührt wird, und eine daraus gezogene Arbeitszellbank für den Routinebetrieb.

Das Auftauen kehrt die Logik des Einfrierens um: langsam abkühlen, schnell auftauen. Langsames Erwärmen erlaubt es kleinen Eiskristallen, zu großen und schädigenden zu rekristallisieren; Tempo durch den Übergang wirkt also schützend.

1. Bereiten Sie alles vor, bevor Sie das Röhrchen holen. Wärmen Sie vollständiges Wachstumsmedium auf 37 C vor und halten Sie eine beschriftete Flasche oder ein beschriftetes Röhrchen bereit. Das Röhrchen soll so kurz wie möglich außerhalb der Lagerung sein.
2. Entnehmen Sie es mit Gesichtsschutz und Kryohandschuhen. Transportieren Sie es in einem kleinen Behälter mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff, wenn der Weg länger als ein paar Sekunden ist.
3. Tauen Sie zügig im 37-C-Wasserbad auf, 1-2 Minuten, unter leichtem Schwenken. Halten Sie den Deckel über der Wasserlinie, um das Gewinde nicht zu kontaminieren. Hören Sie auf, solange noch ein kleiner Eiskristall vorhanden ist - erwärmen Sie das Röhrchen nicht auf 37 C. Ein vollständig aufgetautes Röhrchen im Wasserbad bedeutet Zellen in DMSO bei 37 C, also genau das, was Sie vermeiden wollen.
4. Dekontaminieren Sie die Außenseite des Röhrchens mit 70% Ethanol, bevor Sie es in der Werkbank öffnen.
5. Verdünnen Sie langsam. Überführen Sie den Inhalt in ein Röhrchen und geben Sie vorgewärmtes Medium zunächst tropfenweise, dann zügiger zu, bis auf etwa das Zehnfache des Röhrchenvolumens. Schnelle Mediumzugabe verursacht einen osmotischen Schock: Die Zelle ist mit DMSO beladen, und plötzliches Verdünnen der äußeren Lösung treibt Wasser schnell hinein. Dieser Schritt ist die häufigste Ursache für schlechte Erholung aus einem korrekt eingefrorenen Röhrchen.
6. Entfernen Sie das DMSO. Entweder schonend bei 200-300 x g für 5 Minuten zentrifugieren und in frischem Medium resuspendieren oder - bei scherempfindlichen Zellen - direkt in ein größeres Volumen aussäen und das Medium nach 4-24 Stunden wechseln, sobald die Zellen angeheftet sind. Beides ist zulässig; der Weg über die Zentrifugation entfernt das DMSO schneller, der Weg über das direkte Aussäen erspart empfindlichen Zellen einen Zentrifugationsschritt.
7. Säen Sie großzügig dicht aus. Kulturen erholen sich nach dem Auftauen besser, wenn sie dicht sind. Verteilen Sie ein frisch aufgetautes Röhrchen nicht auf mehrere Flaschen.
8. Beurteilen Sie. Prüfen Sie nach 24 Stunden Anheftung und Morphologie. Erwarten Sie aus einer gut angelegten Bank einer etablierten Linie eine Viabilität nach dem Auftauen über 80-90%, wobei Primärzellen und empfindliche Zellen oft darunter liegen.
9. Lassen Sie die Kultur sich erholen, bevor Sie sie verwenden. Geben Sie den Zellen mindestens zwei oder drei Passagen, um zu normaler Verdopplungszeit und Morphologie zurückzufinden, bevor Sie sie für ein Experiment einsetzen. Zellen direkt nach dem Auftauen sind physiologisch nicht normal, und daran erhobene Ergebnisse sind häufig nicht reproduzierbar.

Die klassische Formulierung aus 90% FBS und 10% DMSO enthält genau die beiden Bestandteile, von denen sich die moderne Zellkultur zu lösen versucht.

Serumfreie und von tierischen Bestandteilen freie Einfriermedien. Wenn eine Linie an serumfreies Wachstum angepasst wurde, ist es widersinnig, sie in 90% Serum einzufrieren - man führt das Material wieder ein, das man entfernt hat, setzt die Zellen bei jedem Bank- und Auftauzyklus erneut Serum aus und bringt die Chargenschwankung in den Erholungsschritt zurück. Definierte serumfreie Einfriermedien sind ausgereift, breit verfügbar und für die meisten angepassten Linien vergleichbar leistungsfähig wie serumhaltige Formulierungen. Für jeden Prozess, der auf eine Herstellung zusteuert, ist ein von tierischen Bestandteilen freies Einfriermedium faktisch Pflicht, denn ein rinderstämmiger Bestandteil in der Zellbank ist unabhängig vom Produktionsmedium ein regulatorisches Thema und eine Frage möglicher Fremdagenzien.

Formulierungen für hohe Dichten gibt es für das Banken bei erhöhten Zellkonzentrationen, was zählt, wenn ein einzelnes Röhrchen eine große Kultur beimpfen muss oder wenn der Lagerplatz knapp ist.

DMSO verringern oder weglassen. DMSO hat über seine akute Toxizität hinaus reale Nachteile:

• Es löst in manchen Zelllinien Differenzierung aus - ein gut dokumentierter Effekt, der in einigen Systemen bewusst genutzt wird und in anderen ein unerwünschter Störfaktor ist.
• Es hat dokumentierte Wirkungen auf Genexpression und epigenetische Markierungen, was bei Stammzellen und bei jeder Arbeit, in der der epigenetische Zustand Gegenstand ist, Anlass zur Sorge gibt.
• In der Herstellung von Zelltherapeutika besteht anhaltendes Interesse daran, DMSO im Endprodukt zu verringern oder zu eliminieren; eine Verringerung entlastet zugleich die nachgelagerten Waschschritte.

DMSO-freie, chemisch definierte Kryokonservierungslösungen sind kommerziell erhältlich und kombinieren typischerweise nicht permeierende Zucker wie Trehalose oder Saccharose mit Polymeren und weiteren Schutzstoffen, manchmal mit einem gering toxischen permeierenden Agens. Die Leistung hängt vom Zelltyp ab: Manche Linien frieren darin ebenso gut ein wie in DMSO, andere erholen sich messbar schlechter. Sie sind eine ernsthafte Option und kein universeller Ersatz, und der richtige Weg ist, sie an der eigenen Linie parallel zum bestehenden Verfahren zu testen, bevor eine Bank darauf festgelegt wird.

So bewerten Sie ein neues Einfriermedium:

1. Frieren Sie aus derselben Ernte, bei derselben Dichte und mit demselben Abkühlprofil gepaarte Röhrchen in der bisherigen Formulierung und im Kandidaten ein.
2. Lagern Sie beide über einen aussagekräftigen Zeitraum - mindestens eine Woche, besser länger, da manche Unterschiede erst nach längerer Lagerung auftreten.
3. Tauen Sie parallel auf und vergleichen Sie die unmittelbare Viabilität nach dem Auftauen, die Anheftung nach 24 Stunden, die Zeit bis zur Rückkehr zur normalen Verdopplung und den funktionellen Endpunkt, auf den es in Ihrer Arbeit ankommt.
4. Stellen Sie die Bank erst dann um und behalten Sie Röhrchen der alten Formulierung, bis sich die neue über einen vollständigen Zyklus bewährt hat.