Penicillin-Streptomycin und Antibiotikum-Antimykotikum in der Zellkultur

Pen-Strep wird als 100X-Konzentrat verkauft, und das ist das einzige Format, das Ihnen im Normalfall begegnet. Die Standardzusammensetzung ist herstellerübergreifend festgelegt:

Penicillin-Streptomycin, 100X

Antibiotikum-Antimykotikum, 100X

Beide werden üblicherweise in 0.85-0.9%iger Kochsalzlösung formuliert und sterilfiltriert. Für den Einsatz geben Sie 10 mL der 100X-Lösung pro Liter Medium zu, also 5 mL pro 500-mL-Flasche.

Beachten Sie, dass Penicillin in Einheiten angegeben wird und nicht als Masse -- eine historische Konvention aus der Zeit, als Penicillinpräparate von schwankender Reinheit waren. Für Penicillin-G-Natrium entspricht 1 Einheit etwa 0.6 ug, sodass 100 U/mL rund 60 ug/mL entsprechen. Streptomycin wird als Masse angegeben. Rechnen Sie die beiden Angaben nicht ineinander um und gehen Sie nicht davon aus, dass beide Komponenten in gleicher Wirkstärke vorliegen.

Eine niedrigere Option. Die ATCC empfiehlt dort, wo überhaupt Antibiotika eingesetzt werden, eine Endkonzentration von 50-100 IU/mL Penicillin und 50-100 ug/mL Streptomycin. Am unteren Ende dieses Bereichs zu arbeiten -- praktisch 0.5X -- senkt die Stoffwechselbelastung und die unerwünschten Nebenwirkungen und erhält dabei den größten Teil der antibakteriellen Wirkung; für empfindliche Zellen ist das eine Überlegung wert.

Penicillin G ist ein Beta-Lactam aus Schimmelpilzen der Gattung Penicillium. Es bindet an Penicillin-bindende Proteine und blockiert den durch Transpeptidasen katalysierten Quervernetzungsschritt der Peptidoglycansynthese, sodass Bakterien keine funktionsfähige Zellwand fertigstellen können und beim Teilungsversuch lysieren. Weil es am Aufbau der Zellwand ansetzt, wirkt es nur gegen aktiv wachsende Keime bakterizid. Sein Spektrum ist im Zellkulturalltag überwiegend grampositiv.

Streptomycin ist ein Aminoglykosid aus Streptomyces griseus. Es bindet an die ribosomale 30S-Untereinheit, führt zur Fehlablesung der mRNA und blockiert den Start der Translation, was bakterizid wirkt. Sein Spektrum ist überwiegend gramnegativ, mit brauchbarer Wirkung gegen einige grampositive Keime. Genau diese sich ergänzenden Spektren sind der Grund für die Kombination: gemeinsam decken sie die bakteriellen Verunreinigungen ab, die am häufigsten über Haut, Luft und Wasser in eine Kulturflasche gelangen.

Amphotericin B, die antimykotische Komponente, ist ein Polyen-Makrolid aus Streptomyces nodosus und wird häufig unter dem Handelsnamen Fungizone geführt. Es bindet Ergosterol in Pilzmembranen und lagert sich zu Poren zusammen, durch die Ionen und kleine Moleküle austreten; Hefen und Schimmelpilze werden dadurch abgetötet.

Bei Amphotericin B ist eine besondere Vorsicht geboten. Seine Selektivität beruht darauf, dass es Ergosterol dem Cholesterin vorzieht, doch diese Bevorzugung ist graduell und nicht absolut. Oberhalb von etwa 2.5 ug/mL wird es messbar toxisch für Säugerzellen, weshalb die Arbeitskonzentration bei 0.25 ug/mL gehalten wird -- ein Sicherheitsabstand um den Faktor zehn, der schmaler ist, als die meisten annehmen. Der Stoff ist zudem instabil, lichtempfindlich und neigt dazu, aus der Lösung auszufallen. Wenn eine mit Anti-Anti versetzte Kultur langsamer wächst als dieselben Zellen in reinem Pen-Strep, ist Amphotericin B die erste Verdachtsursache.

Gentamicin, separat erhältlich, ist ein breiter wirksames Aminoglykosid, das mit 10-50 ug/mL eingesetzt wird. Es ist im Medium deutlich stabiler als Penicillin und wird deshalb häufig für die Arbeit mit Primärgewebe und für lange Kulturzeiträume bevorzugt, in denen die Penicillinaktivität ohnehin abfallen würde.

Die beiden Bestandteile von Pen-Strep bauen sich nicht gleich schnell ab, und das ist wichtiger, als üblicherweise anerkannt wird.

Penicillin G ist chemisch empfindlich. Der Beta-Lactam-Ring hydrolysiert in wässriger Lösung, und der Vorgang beschleunigt sich bei 37 °C und im alkalischen pH-Bereich. Im Vollmedium bei Inkubatortemperatur verliert Penicillin innerhalb von etwa drei Tagen einen erheblichen Teil seiner Aktivität und ist nach rund fünf Tagen weitgehend verbraucht. Eine am Montag gefütterte Flasche hat am Donnerstag spürbar weniger Penicillinschutz.

Streptomycin ist deutlich stabiler und behält über ein normales Mediumwechselintervall hinweg eine brauchbare Aktivität.

Praktisch bedeutet das: Pen-Strep in einer wöchentlich gefütterten Kultur ist über weite Teile dieser Woche faktisch Streptomycin allein mit Penicillinresten. Das erklärt zum Teil die häufige Beobachtung, dass grampositive Kontaminationen in nominell geschützten Kulturen durchbrechen. Wenn die antibiotische Abdeckung für ein bestimmtes Experiment wirklich zählt, spricht das für häufigere Mediumwechsel oder für einen stabileren Wirkstoff wie Gentamicin -- nicht für eine höhere Pen-Strep-Dosis.

Lagerung des Konzentrats. Lagern Sie 100X-Lösungen gefroren bei -5 bis -20 °C und vor Licht geschützt. Tauen Sie bei 2-8 °C oder bei Raumtemperatur auf, nicht bei 37 °C, mischen Sie vorsichtig und vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Teilen Sie eine große Flasche beim ersten Auftauen in Einzelportionen auf. Sobald das Konzentrat ins Medium verdünnt ist, gilt für das Medium die oben beschriebene begrenzte antibiotische Lebensdauer.

Autoklavieren oder erhitzen Sie diese Lösungen nicht, und geben Sie das Konzentrat nicht in Medium, das vor dem Gebrauch längere Zeit bei 37 °C angewärmt wird.

Das ist die Frage, die die meisten tatsächlich stellen, wenn sie nach Pen-Strep suchen, und sie verdient eine klare Antwort statt einer Produktbeschreibung.

Zellbanken und erfahrene Kulturlabore sind sich einig, dass ein routinemäßiger, dauerhafter Antibiotikazusatz in gesunden etablierten Kulturen keine gute Praxis ist. Die ATCC erklärt unmissverständlich, dass sie für die Routinezellkultur weder Antibiotika noch Antimykotika verwendet und dass der Routineeinsatz nicht empfohlen wird, sofern er nicht ausdrücklich erforderlich ist -- etwa ein Selektionsmittel wie G418, das den Selektionsdruck auf eine transfizierte Linie aufrechterhält. Diese Haltung ist keine Zimperlichkeit; sie stützt sich auf mehrere konkrete Probleme.

Antibiotika verdecken Kontaminationen, statt sie zu verhindern. Das ist das zentrale Argument. Pen-Strep sterilisiert eine Kultur nicht, es drückt das Bakterienwachstum nur unter die Schwelle, ab der es Ihnen auffallen würde. Ein schwacher Kontaminant, der das Medium binnen zwei Tagen trüb gemacht hätte und sofort entdeckt worden wäre, kann stattdessen monatelang unauffällig fortbestehen, den pH-Wert verschieben, Nährstoffe verbrauchen, Endotoxin freisetzen und das Verhalten Ihrer Zellen verändern, während die Flasche normal aussieht. Die Kontamination wird dann spät entdeckt, nachdem sie sich auf andere Kulturen ausgebreitet und die Ergebnisse still beeinflusst hat.

Gegen Mykoplasmen richten sie nichts aus. Mykoplasmen besitzen keine Zellwand, Penicillin hat also überhaupt keinen Angriffspunkt. Auch Streptomycin ist bei 100 ug/mL nicht zuverlässig wirksam. Mykoplasmen sind mit deutlichem Abstand der folgenreichste Kulturkontaminant -- sie sind unsichtbar, in einem erheblichen Teil der zirkulierenden Kulturen vorhanden und verändern Stoffwechsel, Wachstumsrate und Genexpression. Pen-Strep bietet dagegen keinerlei Schutz, und indem es die sichtbare bakterielle Kontamination unterdrückt, die Sie zum Verwerfen einer verdächtigen Flasche veranlasst hätte, kann es das Leben einer mykoplasmenpositiven Kultur sogar verlängern.

Sie sind für Ihre Zellen nicht biologisch neutral. Veröffentlichte Arbeiten zeigen, dass Antibiotika in üblichen Kulturkonzentrationen die Genexpression in Säugerzellen verändern und funktionelle Auslesewerte beeinflussen können -- eine Studie fand, dass Antibiotika die Sphärenbildung in Suspensionskultur hemmten. Amphotericin B hat dabei einen besonders schmalen Abstand zwischen antimykotischer und zytotoxischer Konzentration. Wenn Ihr Experiment irgendetwas Feines misst, sind Antibiotika darin eine unkontrollierte Variable.

Sie fördern Resistenzen. Dauerhafte subletale Exposition in einer warmen, nährstoffreichen Umgebung entspricht nahezu idealen Bedingungen für die Auslese resistenter Keime. Labore, die durchgehend Antibiotika einsetzen, handeln sich mit der Zeit Verunreinigungen ein, gegen die Antibiotika nichts mehr ausrichten.

Sie ersetzen die Arbeitstechnik. Der schädlichste Effekt ist eher kultureller als biologischer Natur. Ein Labor, das sich auf Antibiotika verlässt, entdeckt seine eigenen Fehler beim aseptischen Arbeiten nicht mehr, weil das Rückmeldesignal -- eine trübe Flasche am Tag nach einer nachlässigen Sitzung an der Sicherheitswerkbank -- entfernt wurde.

Wo Antibiotika wirklich gerechtfertigt sind:

• Isolierung von Primärgewebe, wo das Ausgangsmaterial nicht steril ist und sich das Gewebe nicht einfach ersetzen lässt.
• Zellsortierung und Durchflusszytometrie, wo die Fluidik des Geräts keine sterile Umgebung ist.
• Unersetzliches Material -- eine einmalige Patientenprobe oder eine schwierige Primärlinie --, bei dem der Verlust der Kultur schwerer wiegt als die Nachteile, und in der Regel nur zeitlich befristet statt dauerhaft.
• Kurzfristige Rettung eines wertvollen Stammes, gefolgt vom Aufbau einer sauberen Arbeitsbank ohne Antibiotika.
• Bioprozesse im großen Maßstab, bei denen eine definierte Risikobewertung zu dem Schluss kommt, dass der Einsatz überwiegt.

Ein praktikabler Kompromiss, den viele Labore fahren: Master- und Arbeitsstämme antibiotikafrei halten, damit sich jede Kontamination sofort zu erkennen gibt, und Antibiotika nur einzelnen Experimenten zusetzen, in denen das Risikoprofil es rechtfertigt. Wenn Sie derzeit überall Pen-Strep einsetzen, ist das nützliche Experiment, eine gut laufende Linie für einige Passagen antibiotikafrei zu führen und zu sehen, ob tatsächlich etwas passiert. In einem Labor mit solider Technik passiert meistens nichts.

Antibiotika zuzusetzen oder zu erhöhen ist selten die richtige Reaktion auf eine sichtbare Kontamination.

Bakterielle oder pilzliche Kontamination in einer ersetzbaren Kultur: verwerfen. Autoklavieren oder dekontaminieren Sie die Flasche, entsorgen Sie die Mediumflasche und alle Reagenzportionen, die zur selben Zeit offen standen, dekontaminieren Sie Inkubator und Sicherheitswerkbank und starten Sie neu aus einem eingefrorenen Kryoröhrchen. Der Versuch, eine sichtbar kontaminierte Kultur zu behandeln, führt meist zu einem unterdrückten, aber fortbestehenden Kontaminanten und birgt das Risiko, ihn im ganzen Inkubator zu verteilen.

Suchen Sie die Quelle, statt das Symptom zu behandeln. Wiederkehrende Kontamination hat eine Ursache: ein Wasserbad, die Wasserschale des Inkubators, ein gerissener Filter in der Werkbank, eine unsaubere Pipettierhilfe, eine gemeinsam genutzte Mediumflasche oder ein bestimmter Handgriff. Antibiotika verwischen genau die Hinweise, die Sie zum Auffinden der Ursache brauchen.

Testen Sie unabhängig und regelmäßig auf Mykoplasmen. PCR- und lumineszenzbasierte Mykoplasmentests sind günstig und schnell. Testen Sie neue Linien bei Ankunft, testen Sie vor dem Einlagern und danach in regelmäßigen Abständen. Kein routinemäßig eingesetztes Antibiotikum ersetzt die Testung. Es gibt spezielle Anti-Mykoplasmen-Reagenzien, die eine infizierte Kultur sanieren können, doch sie sind ein Rettungswerkzeug für unersetzliches Material und keine Erhaltungsstrategie; sanierte Kulturen sollten erneut getestet und neu eingelagert werden.

Halten Sie eingehende Kulturen in Quarantäne. Von Kooperationspartnern eintreffende Zellen sind der mit Abstand häufigste Weg, auf dem Mykoplasmen in ein Labor gelangen. Behandeln Sie sie bis zum Testergebnis getrennt.

Prüfen Sie die Reagenzien. Serum, Trypsin und Medium kommen als Quelle infrage. Seriöse Anbieter prüfen auf Keimbelastung und Mykoplasmen, und Analysenzertifikate sollten gelesen und nicht ungeprüft abgeheftet werden.

Zugabe zum Medium. Geben Sie das 100X-Konzentrat mit 10 mL pro Liter zu, nachdem das Medium angesetzt und gegebenenfalls filtriert wurde. Mischen Sie durch vorsichtiges Schwenken. Ein erneutes Filtrieren ist nicht nötig -- das Konzentrat wird sterilfiltriert geliefert.

Gleichen Sie den Abbau nicht durch Überdosierung aus. Die doppelte Pen-Strep-Konzentration verdoppelt den Schutz nicht, erhöht aber die unerwünschten Wirkungen auf Ihre Zellen. Wenn die Wirkdauer das Problem ist, wechseln Sie das Medium häufiger oder verwenden Sie einen stabileren Wirkstoff.

Serumfreie und chemisch definierte Medien. Zellen in serumfreiem Medium reagieren im Allgemeinen empfindlicher auf chemischen Stress als dieselben Zellen in 10 % Serum, da Serumproteine viele Verbindungen abpuffern und binden. Wenn Sie in einem serumfreien Prozess Antibiotika einsetzen, beobachten Sie Wachstumsrate und Lebensfähigkeit nach der Umstellung genau und erwägen Sie das untere Ende des Konzentrationsbereichs.

Selektionsantibiotika sind eine andere Sache. Puromycin, G418, Hygromycin, Blasticidin und Zeocin dienen dazu, den Selektionsdruck auf gentechnisch veränderte Zellen aufrechtzuerhalten, nicht der Verhinderung von Kontaminationen. Die Argumente gegen den routinemäßigen antibakteriellen Einsatz gelten für sie nicht, wohl aber der Hinweis, zu überprüfen, ob Ihr Transgen noch exprimiert wird.

Dokumentation. Halten Sie fest, ob ein bestimmtes Experiment mit oder ohne Antibiotika gelaufen ist. Es ist eine Variable, sie wirkt sich auf manche Auslesewerte aus, und es lohnt sich, das im Nachhinein prüfen zu können, wenn Ergebnisse zwischen Laboren nicht übereinstimmen.