Solución de Trypan Blue al 0.4%

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• Contaminación en el cultivo celularLa contaminación del cultivo celular se agrupa en seis categorías: bacterias, levaduras, hongos filamentosos y mohos, micoplasma, virus y contaminación cruzada con otra línea celular. Las bacterias, las levaduras y los hongos se manifiestan en un plazo de uno a cinco días mediante turbidez, un cambio de pH o partículas visibles al microscopio, y se resuelven descartando el cultivo y localizando el fallo de técnica que permitió su entrada. El micoplasma, la contaminación viral y la identificación errónea de la línea celular no producen ningún cambio visible y solo se detectan mediante ensayos: PCR o tinción de ADN para el micoplasma, y perfil de STR para la identidad. La respuesta correcta ante cualquier contaminación biológica confirmada es descartar el cultivo afectado, descontaminar el incubador y reiniciar a partir de un vial congelado limpio.
• Recuento de células con hemocitómetroUn hemocitómetro es un portaobjetos de vidrio grueso con una cuadrícula grabada con precisión sobre la que un cubreobjetos crea una cámara de exactamente 0,1 mm de profundidad, de modo que un volumen conocido de suspensión celular puede contarse al microscopio y convertirse en una concentración. Para células de mamífero se cuentan los cuatro cuadros de las esquinas de 1 mm2, se calcula la media, se multiplica por el factor de dilución y se multiplica por 10^4 para obtener células por mL, porque cada cuadro de esquina encierra exactamente 10^-4 mL. Mezclar la muestra 1:1 con azul de tripano al 0,4% antes de cargar la cámara permite obtener el porcentaje de viabilidad a partir del mismo recuento, ya que solo las células muertas, con la membrana comprometida, captan el colorante.
• Azul de tripano y el ensayo de viabilidad por exclusión de coloranteEl azul de tripano es un colorante diazoico que se emplea al 0.4% (p/v) para separar las células vivas de las muertas mediante exclusión de colorante: una membrana plasmática intacta impide la entrada del colorante cargado, de modo que las células viables permanecen transparentes y refringentes, mientras que las células con la membrana dañada lo incorporan y se tiñen de azul. En la práctica, la suspensión celular se mezcla 1:1 con azul de tripano al 0.4%, se carga en un hemocitómetro o en un contador celular automático y se cuenta en un plazo de 3-5 minutos para obtener a la vez una concentración celular y un porcentaje de viabilidad. Como solo informa sobre la integridad de la membrana, el azul de tripano cuenta las células que ya han muerto: no detecta células apoptóticas ni metabólicamente deterioradas que aún conservan la membrana intacta, por lo que da valores más altos que los ensayos de viabilidad metabólicos o por citometría de flujo.
• Tampón de lisis ACKEl tampón de lisis ACK (cloruro de amonio-potasio) es una solución isotónica de cloruro de amonio que se emplea para eliminar los eritrocitos de preparaciones de leucocitos como el bazo de ratón, la médula ósea y la capa leucocitaria. La composición estándar es 150 mM de cloruro de amonio (8.02 g/L de NH4Cl), 10 mM de bicarbonato de potasio (1.0 g/L de KHCO3) y 0.1 mM de EDTA disódico, ajustada a pH 7.2-7.4. Los eritrocitos se lisan osmóticamente en uno a cinco minutos a temperatura ambiente, porque su intercambiador aniónico banda 3 y su elevada actividad anhidrasa carbónica impulsan la entrada de cloruro de amonio y agua en la célula, mientras que los leucocitos, que carecen de esa capacidad de transporte, sobreviven.
• Puromicina para la selección de células de mamíferoLa puromicina es un antibiótico aminonucleósido producido por Streptomyces alboniger que imita el extremo aminoacilo del ARNt, entra en el sitio A ribosómico y provoca la liberación prematura de una cadena peptídica truncada, con lo que mata a las células incapaces de inactivarla. En cultivo de células de mamífero se emplea como agente de selección a 0.5-10 ug/mL, lo más habitual 1-2 ug/mL, y elimina las células no resistentes más rápido que cualquier otro antibiótico de selección común: normalmente en 2-5 días. La resistencia la confiere el gen pac, que codifica la puromicina N-acetiltransferasa, la cual acetila el fármaco y lo deja inactivo. Como la concentración eficaz depende mucho de la línea celular, de la densidad celular y del contenido de suero, hay que realizar una curva de mortalidad para cada nueva línea celular y cada nuevo lote de puromicina.
• Células Sf9 y el sistema de expresión con baculovirusSf9 es una línea celular clonal de insecto aislada a partir de Sf21, que a su vez se estableció a partir de tejido ovárico pupal del gusano cogollero *Spodoptera frugiperda*. Es el hospedador estándar del sistema de vectores de expresión de baculovirus, empleado para producir proteínas recombinantes, partículas similares a virus y AAV. Las células Sf9 crecen a 27 C sin CO2 en medios para insecto tamponados con fosfato a pH 6.2-6.4, se adaptan con facilidad al cultivo en suspensión sin suero a 100-130 rpm y se duplican cada 18-24 horas. Los cultivos se subcultivan cuando alcanzan aproximadamente 2.5-3.5 x 10^6 células/mL y se diluyen hasta cerca de 1 x 10^6 células/mL, y las infecciones se realizan sobre células sanas en fase exponencial con una viabilidad superior al 95%.
• Células DF-1, fibroblastos de embrión de polloDF-1 (UMNSAH/DF-1, ATCC CRL-12203) es una línea de fibroblastos de embrión de pollo inmortalizada de forma espontánea, derivada de embriones de la línea East Lansing Line 0, una línea de pollo libre de loci del virus de la leucosis aviar endógeno. Como no porta retrovirus endógenos y se inmortalizó sin transformación viral ni química, es el sustituto continuo estándar de los fibroblastos primarios de embrión de pollo en virología aviar, desarrollo de vacunas y producción de virus recombinantes. Las células DF-1 se cultivan en DMEM con alta glucosa y 10% de suero fetal bovino a 37 C y 5% CO2, crecen más rápido que los CEF primarios, se transfectan con eficiencia y sostienen la replicación de la influenza aviar, el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, los virus de la leucosis y el sarcoma aviares y muchos otros patógenos aviares con títulos iguales o superiores a los de los CEF.
• Subcultivo celular (pase)El subcultivo celular, también llamado pase, es el traspaso de las células de un cultivo que se aproxima a la confluencia a recipientes nuevos con medio fresco para que el crecimiento pueda continuar. Las células adherentes se despegan primero, normalmente con Trypsin-EDTA al 0.25% o al 0.05% o con un reactivo de disociación no enzimático, y se vuelven a sembrar a una densidad menor fijada por una proporción de división como 1:4; las células en suspensión simplemente se diluyen en medio fresco sin ningún paso de disociación. La mayoría de las líneas celulares adherentes continuas se subcultivan al 70-80% de confluencia, lo que suele significar dos o tres pases por semana.
• Medio de congelación celular y protocolos de criopreservaciónEl medio de congelación celular es una disolución con crioprotector que permite a las células sobrevivir a la congelación y al almacenamiento prolongado; lo más habitual es prepararlo con un medio basal o suero más un 5-10 % de dimetilsulfóxido (DMSO), siendo el 10 % el punto de partida estándar. El DMSO penetra en la célula y modifica la forma en que se congela el agua, evitando los cristales de hielo intracelulares que de otro modo romperían las membranas durante el enfriamiento. Las células se congelan a una velocidad controlada de aproximadamente 1 C por minuto hasta -80 C y después se trasladan a la fase de vapor del nitrógeno líquido, ya que el almacenamiento prolongado exige temperaturas por debajo de unos -135 C para impedir la recristalización del hielo. La descongelación es lo contrario: lo más rápida posible en un baño de agua a 37 C, seguida de una dilución inmediata para eliminar el DMSO, que resulta tóxico para las células por encima de las temperaturas de congelación.