DPBS sin calcio ni magnesio, sin rojo de fenol

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• Contaminación en el cultivo celularLa contaminación del cultivo celular se agrupa en seis categorías: bacterias, levaduras, hongos filamentosos y mohos, micoplasma, virus y contaminación cruzada con otra línea celular. Las bacterias, las levaduras y los hongos se manifiestan en un plazo de uno a cinco días mediante turbidez, un cambio de pH o partículas visibles al microscopio, y se resuelven descartando el cultivo y localizando el fallo de técnica que permitió su entrada. El micoplasma, la contaminación viral y la identificación errónea de la línea celular no producen ningún cambio visible y solo se detectan mediante ensayos: PCR o tinción de ADN para el micoplasma, y perfil de STR para la identidad. La respuesta correcta ante cualquier contaminación biológica confirmada es descartar el cultivo afectado, descontaminar el incubador y reiniciar a partir de un vial congelado limpio.
• Recuento de células con hemocitómetroUn hemocitómetro es un portaobjetos de vidrio grueso con una cuadrícula grabada con precisión sobre la que un cubreobjetos crea una cámara de exactamente 0,1 mm de profundidad, de modo que un volumen conocido de suspensión celular puede contarse al microscopio y convertirse en una concentración. Para células de mamífero se cuentan los cuatro cuadros de las esquinas de 1 mm2, se calcula la media, se multiplica por el factor de dilución y se multiplica por 10^4 para obtener células por mL, porque cada cuadro de esquina encierra exactamente 10^-4 mL. Mezclar la muestra 1:1 con azul de tripano al 0,4% antes de cargar la cámara permite obtener el porcentaje de viabilidad a partir del mismo recuento, ya que solo las células muertas, con la membrana comprometida, captan el colorante.
• HBSS (solución salina equilibrada de Hank)El HBSS (solución salina equilibrada de Hank) es una solución salina equilibrada isotónica que se emplea para lavar células, transportar tejido, diluir reactivos y mantener células durante periodos breves fuera de su medio de cultivo. Contiene 8.0 g/L de cloruro de sodio, 1.0 g/L de D-glucosa, fosfato y 350 mg/L de bicarbonato de sodio, y se suministra con calcio y magnesio (1.26 mM de Ca y ~0.9 mM de Mg totales) o sin ellos. Su bajo contenido de bicarbonato significa que está diseñado para usarse a CO2 atmosférico o en recipientes cerrados, no para cultivos prolongados en un incubador con 5% CO2.
• Azul de tripano y el ensayo de viabilidad por exclusión de coloranteEl azul de tripano es un colorante diazoico que se emplea al 0.4% (p/v) para separar las células vivas de las muertas mediante exclusión de colorante: una membrana plasmática intacta impide la entrada del colorante cargado, de modo que las células viables permanecen transparentes y refringentes, mientras que las células con la membrana dañada lo incorporan y se tiñen de azul. En la práctica, la suspensión celular se mezcla 1:1 con azul de tripano al 0.4%, se carga en un hemocitómetro o en un contador celular automático y se cuenta en un plazo de 3-5 minutos para obtener a la vez una concentración celular y un porcentaje de viabilidad. Como solo informa sobre la integridad de la membrana, el azul de tripano cuenta las células que ya han muerto: no detecta células apoptóticas ni metabólicamente deterioradas que aún conservan la membrana intacta, por lo que da valores más altos que los ensayos de viabilidad metabólicos o por citometría de flujo.
• Tampón de lisis ACKEl tampón de lisis ACK (cloruro de amonio-potasio) es una solución isotónica de cloruro de amonio que se emplea para eliminar los eritrocitos de preparaciones de leucocitos como el bazo de ratón, la médula ósea y la capa leucocitaria. La composición estándar es 150 mM de cloruro de amonio (8.02 g/L de NH4Cl), 10 mM de bicarbonato de potasio (1.0 g/L de KHCO3) y 0.1 mM de EDTA disódico, ajustada a pH 7.2-7.4. Los eritrocitos se lisan osmóticamente en uno a cinco minutos a temperatura ambiente, porque su intercambiador aniónico banda 3 y su elevada actividad anhidrasa carbónica impulsan la entrada de cloruro de amonio y agua en la célula, mientras que los leucocitos, que carecen de esa capacidad de transporte, sobreviven.
• Trypsin-EDTAEl Trypsin-EDTA es un reactivo de disociación celular que combina la tripsina, una serina proteasa que corta enlaces peptídicos por el lado C-terminal de los residuos de lisina y arginina en las proteínas de superficie y de la matriz, con el quelante EDTA, que fija los iones calcio y magnesio que necesitan las moléculas de adhesión celular. Se suministra en una solución salina equilibrada sin calcio ni magnesio, lo más habitual al 0.05% de tripsina (0.5 g/L) para líneas celulares de rutina y al 0.25% (2.5 g/L) para células firmemente adheridas y cultivos primarios. El uso típico son 2-5 minutos a 37 °C, seguidos de inmediato por la neutralización con medio con suero o con un inhibidor de tripsina definido.
• PBS frente a DPBS: en qué se diferencian y cuál conviene usarEl PBS y el DPBS son ambos soluciones salinas tamponadas con fosfato; la diferencia está en la fórmula, no en la función. La formulación de Dulbecco (DPBS) añade cloruro de potasio y contiene aproximadamente el doble de fosfato que un PBS típico (unos 9.5 mM frente a unos 4 mM), y se comercializa en dos versiones: con calcio y magnesio, y sin ellos. En la práctica, la elección entre llevar o no cationes divalentes importa mucho más que la etiqueta PBS o DPBS: use una solución sin calcio ni magnesio para lavar las células antes de la tripsinización o de la disociación con EDTA, porque el Ca2+ y el Mg2+ sostienen precisamente los enlaces de cadherinas e integrinas que va a romper, y use la versión con calcio y magnesio cuando las células deban permanecer adheridas e intactas durante el lavado.
• El yodixanol como medio de gradiente de densidadEl yodixanol es un compuesto yodado no iónico y soluble en agua que se emplea como medio de gradiente de densidad, y se suministra como solución estéril al 60% (p/v) con una densidad de 1.32 g/mL. Su ventaja definitoria es que resulta isoosmótico en todo el intervalo útil de densidad -- una solución al 60% tiene una osmolalidad de aproximadamente 290 mOsm/kg --, de modo que células, orgánulos, virus y vesículas extracelulares pueden bandearse a densidades altas sin la deshidratación osmótica que provoca la sacarosa ni la elevada fuerza iónica del cloruro de cesio. Es el medio estándar para la purificación de AAV a escala de laboratorio, donde un gradiente de cuatro escalones del 15%, 25%, 40% y 60% separa las cápsides que contienen genoma en la interfase 40-60%, y también se usa ampliamente para la separación de células, el fraccionamiento de orgánulos y la flotación de vesículas extracelulares.
• Células DF-1, fibroblastos de embrión de polloDF-1 (UMNSAH/DF-1, ATCC CRL-12203) es una línea de fibroblastos de embrión de pollo inmortalizada de forma espontánea, derivada de embriones de la línea East Lansing Line 0, una línea de pollo libre de loci del virus de la leucosis aviar endógeno. Como no porta retrovirus endógenos y se inmortalizó sin transformación viral ni química, es el sustituto continuo estándar de los fibroblastos primarios de embrión de pollo en virología aviar, desarrollo de vacunas y producción de virus recombinantes. Las células DF-1 se cultivan en DMEM con alta glucosa y 10% de suero fetal bovino a 37 C y 5% CO2, crecen más rápido que los CEF primarios, se transfectan con eficiencia y sostienen la replicación de la influenza aviar, el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, los virus de la leucosis y el sarcoma aviares y muchos otros patógenos aviares con títulos iguales o superiores a los de los CEF.
• Subcultivo celular (pase)El subcultivo celular, también llamado pase, es el traspaso de las células de un cultivo que se aproxima a la confluencia a recipientes nuevos con medio fresco para que el crecimiento pueda continuar. Las células adherentes se despegan primero, normalmente con Trypsin-EDTA al 0.25% o al 0.05% o con un reactivo de disociación no enzimático, y se vuelven a sembrar a una densidad menor fijada por una proporción de división como 1:4; las células en suspensión simplemente se diluyen en medio fresco sin ningún paso de disociación. La mayoría de las líneas celulares adherentes continuas se subcultivan al 70-80% de confluencia, lo que suele significar dos o tres pases por semana.
• Tampones para cultivo celularLos tampones para cultivo celular mantienen el medio en el intervalo de pH 7,2-7,4 que necesitan las células de mamífero, frente a la carga ácida que estas generan al metabolizar. El sistema por defecto en casi todos los medios clásicos es el bicarbonato de sodio trabajando con el CO2 de la atmósfera del incubador, motivo por el cual el contenido de bicarbonato debe ajustarse a la configuración del incubador: unos 1,5-2,2 g/L de NaHCO3 para 5 % de CO2 y 3,7 g/L para 10 % de CO2. Los tampones orgánicos como el HEPES (pKa 7,48) se añaden a 10-25 mM para mantener el pH cuando los cultivos están fuera de una atmósfera de CO2, mientras que las disoluciones tamponadas con fosfato, como el PBS y el DPBS, se emplean para el lavado y la manipulación de corta duración, no para el crecimiento.
• Medio de congelación celular y protocolos de criopreservaciónEl medio de congelación celular es una disolución con crioprotector que permite a las células sobrevivir a la congelación y al almacenamiento prolongado; lo más habitual es prepararlo con un medio basal o suero más un 5-10 % de dimetilsulfóxido (DMSO), siendo el 10 % el punto de partida estándar. El DMSO penetra en la célula y modifica la forma en que se congela el agua, evitando los cristales de hielo intracelulares que de otro modo romperían las membranas durante el enfriamiento. Las células se congelan a una velocidad controlada de aproximadamente 1 C por minuto hasta -80 C y después se trasladan a la fase de vapor del nitrógeno líquido, ya que el almacenamiento prolongado exige temperaturas por debajo de unos -135 C para impedir la recristalización del hielo. La descongelación es lo contrario: lo más rápida posible en un baño de agua a 37 C, seguida de una dilución inmediata para eliminar el DMSO, que resulta tóxico para las células por encima de las temperaturas de congelación.
• Tripsina frente a Accutase: cómo elegir un reactivo de disociación celularLa tripsina es una serina proteasa pancreática que corta los enlaces peptídicos después de lisina y arginina; despega las células deprisa, pero sin discriminar: hay que detenerla con suero o con un inhibidor de tripsina, y corta las proteínas de superficie junto con los contactos de adhesión. Accutase es una mezcla propietaria de enzimas proteolíticas y colagenolíticas de origen invertebrado, suministrada en DPBS sin calcio ni magnesio con 0.5 mM de EDTA; actúa de forma más lenta y suave, no requiere paso de neutralización y conserva más epítopos de superficie. Elija tripsina para el subcultivo rutinario de líneas adherentes robustas, cuando importa la velocidad y las células vuelven directamente al cultivo; elija Accutase cuando las células recogidas son el experimento: citometría de flujo sobre marcadores de superficie, células madre pluripotentes, neuronas primarias o cualquier suspensión de células individuales en la que la viabilidad y el fenotipo deban sobrevivir a la recogida.
• Recubrimiento con poly-L-lysine para cultivo celularEl recubrimiento con poly-L-lysine cubre la superficie de cultivo con un polímero sintético de carga positiva que se une a la membrana plasmática, cargada negativamente, y permite que las células poco adherentes se fijen al vidrio o al plástico. El protocolo estándar aplica una disolución estéril al 0.01% (0.1 mg/mL) a razón de aproximadamente 1 mL por cada 25 cm2, la deja en contacto con la superficie de 5 minutos a 1 hora a temperatura ambiente, la aspira, enjuaga a fondo con agua estéril de grado cultivo celular y seca la superficie al aire durante al menos 2 horas antes de sembrar las células. La adhesión que proporciona es puramente electrostática: la poly-L-lysine no activa las integrinas, de modo que las células que necesitan una señal real de la matriz extracelular requieren laminina, fibronectina o colágeno en su lugar o por encima de ella.