Hücre Kültürü Teknik Kaynak Kütüphanesi
Her besiyerinin, tamponun ve reaktifin gerçekte ne olduğu — bileşimi, kullanımı ve alternatiflerinden farkı. Broşür için değil, laboratuvar tezgâhı için yazıldı.
Media and formulations
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Besiyeri
Kimyasal olarak tanımlanmış besiyeri, içindeki her bileşenin kimliği ve derişimi bilinen bir hücre kültürü besiyeridir — serum yok, protein hidrolizatı yok, tanımsız ekstre yok. Rekombinant olmak ve dizisi ile derişimi bilinmek kaydıyla protein içerebilir; kimyasal olarak tanımlanmış ile protein içermeyen bu yüzden eşanlamlı değil, birbirinden ayrı iki kategoridir. Kimyasal olarak tanımlanmış besiyerleri serumun getirdiği partiler arası değişkenliği, arızi etken riskini ve mevzuat yükünü ortadan kaldırır; CHO, HEK293 ve hibridoma sistemlerinde biyofarmasötik üretimin standardıdır.
→RPMI 1640 Besiyeri
RPMI 1640, insan lökositlerinin süspansiyonda kültürü için 1966 yılında Roswell Park Memorial Institute'ta geliştirilmiş bazal bir hücre kültürü besiyeridir. 2.000 mg/L glukoz (11,1 mM), %5 CO2 ortamına göre tamponlanmış 2.000 mg/L sodyum bikarbonat (23,8 mM), alışılmadık ölçüde yüksek fosfat (yaklaşık 5,6 mM), düşük kalsiyum (yaklaşık 0,42 mM) ve indirgenmiş glutatyon, biyotin, B12 vitamini, para-aminobenzoik asit ile hidroksiprolini kapsayan kendine özgü bir bileşen kümesi içerir. Lenfositler, hibridomalar ve süspansiyona adapte edilmiş hematopoetik ve lenfoid hücre hatlarının çoğu için standart besiyeridir; normalde %10 fetal sığır serumuyla takviye edilir.
→MEM Alpha (α-MEM) ve Minimum Esansiyel Besiyeri
MEM alpha (α-MEM), Eagle'in Minimum Esansiyel Besiyeri'nin tüm esansiyel olmayan amino asitler, sodyum piruvat, lipoik asit, askorbik asit, biyotin ve B12 vitamini ile zenginleştirilmiş biçimidir; ribonükleozit ve deoksiribonükleozit içeren ya da içermeyen olarak sunulur. Tuz temeli MEM ile aynıdır — %5 CO2 atmosferine göre ayarlanmış 2.200 mg/L sodyum bikarbonat, 1.000 mg/L glukoz ve 1,8 mM kalsiyum — ve mezenkimal stromal hücreler, kemik iliği kültürleri, osteoblastlar, CHO-DXB11 ile CHO-DG44 seleksiyonu ve pek çok primer hücre tipi için standart besiyeridir. HAT ve metotreksat temelli seleksiyon sistemlerinde nükleozit içermeyen versiyon zorunludur.
→DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri)
DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri), Eagle'ın Minimal Esansiyel Besiyeri'ndeki amino asit ve vitamin derişimlerinin yaklaşık dört katına çıkarılmasıyla türetilmiş bazal bir hücre kültürü besiyeridir. Yüksek glukozlu (4.500 mg/L, 25 mM) ve düşük glukozlu (1.000 mg/L, 5,6 mM) biçimlerde sunulur, 3.700 mg/L sodyum bikarbonat ile tamponlanır ve fizyolojik pH'ı koruyabilmek için serum ya da tanımlı bir takviyenin yanı sıra CO2 atmosferi gerektirir. DMEM; HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero ve CHO kökenli yapışkan kültürler gibi adherent hatların ve çoğu primer fibroblastın varsayılan besiyeridir.
→Hücre Kültürü Besiyerinde Fenol Kırmızısı
Fenol kırmızısı (fenolsülfonftalein), hücre kültürü besiyerlerine yaklaşık 5-15 mg/L düzeyinde katılan bir pH indikatörüdür; yaklaşık pH 6.8'in altında sarıya, yaklaşık pH 8.2'nin üzerinde pembeden fuşyaya döner, sağlıklı besiyerinin normal kırmızı-turuncusu ise pH 7.4 dolayına oturur. Besiyerinin sarıya dönmesi asitlenme demektir — neredeyse her zaman hücre metabolizmasından, aşırı büyümüş bir kültürden ya da bakteriyel kontaminasyondan gelen laktat; pembeye ya da mora dönmesi ise besiyerinin alkaliye kaydığını, yani neredeyse her zaman bikarbonat tamponundan CO2'nin kaçtığını gösterir. Fenol kırmızısı kendisi hiçbir tamponlama yapmaz, tümüyle tanısaldır; floresan ve absorbans testlerinde ve östrojene yanıt veren hücrelerle çalışmalarda boya ölçümü bozduğu için fenol kırmızısı içermeyen besiyeri kullanın.
→Reagents and buffers
Hücre kültüründe HEPES tamponu
HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit), hücre kültüründe besiyerini inkübatör CO2'sine bağlı kalmadan fizyolojik pH'ta tutmak için kullanılan zwitteriyonik bir organik tampondur. pKa'sı 20-25 °C'de yaklaşık 7,5, 37 °C'de ise yaklaşık 7,3'tür; bu da kabaca pH 6,8-8,2 aralığında kullanışlı bir tamponlama sağlar ve besiyerine normalde steril 1 M stoktan 10-25 mM olacak şekilde eklenir. HEPES'in tamponlaması karbonik asit/bikarbonat dengesine dayanmadığı için, HEPES ile takviye edilmiş besiyeri, flask %5 CO2'li inkübatörden çıkarıldığında ortaya çıkan hızlı alkali kaymaya direnir.
→HBSS (Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi)
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Hank'in dengeli tuz çözeltisi), hücreleri yıkamak, doku taşımak, reaktif seyreltmek ve hücreleri büyüme besiyeri dışında kısa süre bekletmek için kullanılan izotonik bir dengeli tuz çözeltisidir. Litrede 8,0 g sodyum klorür, 1,0 g D-glukoz, fosfat ve 350 mg/L sodyum bikarbonat içerir; kalsiyum ve magnezyum içeren (1,26 mM Ca, toplam ~0,9 mM Mg) ya da bunları içermeyen formda sunulur. Bikarbonatının düşük olması, HBSS'in atmosferik CO2 altında veya kapalı kaplarda kullanılmak üzere tasarlandığı, %5 CO2'li inkübatörde uzun süreli kültür için düşünülmediği anlamına gelir.
→ACK liziz tamponu
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) liziz tamponu, fare dalağı, kemik iliği ve lökosit tabakası gibi lökosit hazırlıklarından eritrositleri uzaklaştırmak için kullanılan izotonik bir amonyum klorür çözeltisidir. Standart bileşimi 150 mM amonyum klorür (8,02 g/L NH4Cl), 10 mM potasyum bikarbonat (1,0 g/L KHCO3) ve 0,1 mM disodyum EDTA'dır; pH 7,2-7,4'e ayarlanır. Eritrositler oda sıcaklığında bir ila beş dakika içinde ozmotik olarak parçalanır, çünkü band 3 anyon değiştiricileri ve yüksek karbonik anhidraz etkinlikleri amonyum klorürü ve suyu hücrenin içine çeker; bu taşıma kapasitesinden yoksun olan lökositler ise ayakta kalır.
→Memeli Hücre Seçimi için Puromisin
Puromisin, Streptomyces alboniger kaynaklı bir aminonükleozit antibiyotiktir; tRNA'nın aminoaçil ucunu taklit ederek ribozomun A bölgesine girer ve kısalmış bir peptit zincirinin erken salınmasına yol açar, böylece onu etkisizleştiremeyen hücreleri öldürür. Memeli hücre kültüründe 0,5-10 µg/mL aralığında, en yaygın olarak da 1-2 µg/mL derişiminde seçici antibiyotik olarak kullanılır ve dirençli olmayan hücreleri yaygın seçici antibiyotiklerin hepsinden hızlı öldürür — tipik olarak 2-5 gün içinde. Direnç, puromisin N-asetiltransferazı kodlayan pac geniyle sağlanır; bu enzim ilacı asetilleyerek etkisiz hâle getirir. Etkin derişim hücre hattına, hücre yoğunluğuna ve serum içeriğine güçlü biçimde bağlı olduğu için, her yeni hücre hattı ve her yeni puromisin partisi için bir öldürme eğrisi çalışılmalıdır.
→Hücre Kültüründe Penisilin-Streptomisin ve Antibiyotik-Antimikotik
Yaygın olarak Pen-Strep diye kısaltılan penisilin-streptomisin, 10.000 birim/mL penisilin G ile 10.000 µg/mL streptomisin içeren 100X'lik steril bir çözelti olarak sunulur; besiyerine 1:100 seyreltilerek 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisinlik bir çalışma derişimi verir. Penisilin bakteriyel hücre duvarı sentezini engeller ve başlıca Gram-pozitif organizmaları kapsar; streptomisin bakteriyel 30S ribozomal alt birime bağlanır ve başlıca Gram-negatifleri kapsar, dolayısıyla ikili birlikte geniş bir antibakteriyel örtü sağlar. Antibiyotik-antimikotik (anti-anti) aynı bileşimin üzerine 100X'te 25 µg/mL amfoterisin B ekler; kullanımda 0,25 µg/mL vererek antifungal koruma sağlar. Hiçbiri mikoplazmayı denetleyemez ve ATCC dahil başlıca hücre bankaları, düşük düzeyli kontaminasyonu önlemek yerine maskelediği için antibiyotiklerin rutin kullanımını önermez.
→Hücre Kültüründe Sığır Serumu
Sığır serumu, pıhtılaşmış sığır kanının sıvı kısmıdır; bazal besiyerlerinde bulunmayan büyüme faktörlerini, hormonları, taşıyıcı ve tutunma proteinlerini, lipitleri ve eser elementleri sağlamak üzere kültür besiyerine %5-10 oranında eklenir. Fetal sığır serumu (FBS) ile fetal buzağı serumu (FCS) aynı ürünün iki adıdır ve gebe ineklerin kesimi sırasında fetüsten toplanır; yenidoğan buzağı serumu yaklaşık 20 günlükten küçük buzağılardan, donör sığır serumu ise kabaca 12-36 aylık denetimli donör sürülerinden gelir ve her ikisi de FBS'ye göre daha çok immünoglobulin, daha az büyüme faktörü içerir. Serum tanımsız bir biyolojik materyal olduğu, partiler arası değişkenliği yüksek olduğu, hayvan refahı soruları çözülmediği ve tedarik zinciri oynak olduğu için, hücre hattının kaldırabildiği her yerde tanımlı serumsuz ve hayvansal kaynak içermeyen besiyerleri giderek daha çok yeğleniyor.
→Yoğunluk Gradyanı Ortamı Olarak İyodiksanol
İyodiksanol, yoğunluk gradyanı ortamı olarak kullanılan, iyonik olmayan, suda çözünen iyotlu bir bileşiktir; 1,32 g/mL yoğunluğunda steril %60 (w/v) çözelti olarak sunulur. Belirleyici üstünlüğü, kullanışlı yoğunluk aralığının tamamında izoozmotik olmasıdır — %60'lık çözeltinin ozmolalitesi yaklaşık 290 mOsm/kg'dır — böylece hücreler, organeller, virüsler ve hücre dışı veziküller, sükrozun yol açtığı ozmotik su kaybına veya sezyum klorürün yüksek iyonik şiddetine maruz kalmadan yüksek yoğunlukta bantlanabilir. Laboratuvar ölçeğinde AAV saflaştırmasının standart ortamıdır: %15, %25, %40 ve %60'lık dört basamaklı bir gradyan, genom içeren kapsitleri %40-60 arayüzünde ayırır. Ayrıca hücre ayrımı, organel fraksiyonlaması ve hücre dışı vezikül flotasyonunda yaygın olarak kullanılır.
→Sera, supplements and cell lines
Protocols and methods
Hemositometre ile Hücre Sayımı
Hemositometre, üzerine hassas biçimde kazınmış bir ızgara taşıyan kalın bir cam lamdır; üzerine oturtulan lamel tam 0.1 mm derinliğinde bir sayım odacığı oluşturur, böylece bilinen bir hacimdeki hücre süspansiyonu mikroskopta sayılıp derişime çevrilebilir. Memeli hücrelerinde 1 mm2'lik dört köşe karesi sayılır, ortalaması alınır, seyreltme faktörüyle ve 10^4 ile çarpılarak mL başına hücre sayısı bulunur; çünkü her köşe karesi tam olarak 10^-4 mL kapsar. Yüklemeden önce örneğin %0,4 tripan mavisi ile 1:1 karıştırılması, aynı sayımdan bir canlılık yüzdesi de verir: boyayı yalnızca zarı bozulmuş ölü hücreler alır.
→Fetal Sığır Serumunun (FBS) Isıl İnaktivasyonu
Fetal sığır serumunun ısıl inaktivasyonu, serum besiyerine katılmadan önce kompleman kaskadının ısıya duyarlı proteinlerini yok eden, 56 °C'de 30 dakikalık denetimli bir inkübasyondur. Serum çözülür, 37 °C'ye getirilir, 56 °C'lik bir su banyosuna aktarılır, serumun kendisi bu sıcaklığa ulaştığı andan itibaren tam 30 dakika tutulur — bu süre boyunca 5-10 dakikada bir hafifçe çalkalanır — ardından hemen soğutulur ve alikotlara ayrılır. Yerleşik hücre hatlarının rutin kültüründe genellikle gereksizdir; çünkü fetal serumdaki kompleman aktivitesi düşüktür ve ısıtma aynı zamanda ısıya duyarlı büyüme faktörlerini de bozar. Buna karşılık immünolojik testlerde ve komplemana duyarlı hücrelerde standart uygulama olmayı sürdürür.
→Hücrelerin Pasajlanması (Subkültür)
Hücrelerin pasajlanması (subkültür), konflüense yaklaşan bir kültürdeki hücrelerin taze besiyeri bulunan yeni kaplara aktarılarak büyümenin sürdürülmesidir. Yapışkan hücreler önce ayrılır — genellikle %0,25 ya da %0,05 Trypsin-EDTA veya enzimatik olmayan bir ayırma reaktifiyle — sonra 1:4 gibi bir bölme oranıyla belirlenen daha düşük yoğunlukta yeniden ekilir; süspansiyon hücreleri ise hiçbir ayırma adımı olmadan taze besiyerine seyreltilir. Sürekli yapışkan hücre hatlarının çoğu %70-80 konflüenste pasajlanır ve bu, normalde haftada iki ya da üç pasaj anlamına gelir.
→Comparisons
PBS ve DPBS: Fark Nedir, Hangisini Kullanmalı?
PBS ve DPBS'nin ikisi de fosfat tamponlu tuz çözeltisidir; aradaki fark işlevde değil, reçetededir. Dulbecco formülasyonu (DPBS) potasyum klorür ekler ve tipik bir PBS'nin kabaca iki katı fosfat taşır (yaklaşık 4 mM'ye karşı yaklaşık 9,5 mM); ayrıca iki sürüm halinde satılır — kalsiyum ve magnezyum içeren ve içermeyen. Uygulamada iki değerlikli katyonların bulunup bulunmaması, şişenin üzerinde PBS mi DPBS mi yazdığından çok daha önemlidir: hücreleri tripsinleme ya da EDTA ile disosiyasyon öncesinde yıkarken kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir çözelti kullanın, çünkü Ca2+ ve Mg2+ tam da koparmak üzere olduğunuz kaderin ve integrin bağlarını destekler; hücrelerin yıkama boyunca yapışık ve bütün kalması gerektiğinde ise kalsiyum ve magnezyum içeren sürümü seçin.
→Hücre Kültüründe Esansiyel ve Esansiyel Olmayan Amino Asitler
Hücre kültüründe bir amino asit, kültürdeki memeli hücreler onu yeterli miktarda üretemiyorsa ve besiyeriyle verilmesi gerekiyorsa esansiyel sayılır — Harry Eagle'ın tanımladığı on üç amino asit; içlerinde beslenme açısından esansiyel sayılmayan arjinin, sistin, tirozin ve glutamin de vardır. Esansiyel olmayan yedi amino asidi — glisin, alanin, asparajin, aspartik asit, glutamik asit, prolin ve serin — hücrelerin çoğu kendisi sentezleyebilir; buna rağmen besiyerine eklenirler, çünkü onları üretmek büyümeye gidecek karbonu, ATP'yi ve indirgeyici eşdeğerleri tüketir. MEM NEAA 100X takviyesi yedisini de 10 mM'de içerir ve çalışma derişiminde her birinden 0,1 mM sağlar; yedisinden hiçbirini ya da yalnızca birkaçını taşıyan MEM ve DMEM'e ekleyin, yedisini de zaten içeren Ham's F-12, IMDM ve DMEM/F-12'de ise eklemeyin.
→Contamination and quality control
Hücre Kültürü Kontaminasyonu
Hücre kültürü kontaminasyonu altı gruba ayrılır: bakteriler, mayalar, filamentli mantarlar ve küfler, mikoplazma, virüsler ve başka bir hücre hattıyla çapraz kontaminasyon. Bakteri, maya ve mantar kendini bir ila beş gün içinde bulanıklık, pH kayması ya da mikroskopta görülen partiküllerle belli eder; yapılacak şey kültürü atmak ve onların girmesine izin veren aseptik teknik hatasını bulmaktır. Mikoplazma, viral kontaminasyon ve yanlış tanımlanmış hücre hattı ise hiçbir görünür değişiklik yaratmaz; yalnızca test ile saptanır — mikoplazma için PCR veya DNA boyama, kimlik için STR profillemesi. Doğrulanmış her biyolojik kontaminasyonda doğru müdahale aynıdır: etkilenen kültürü atmak, inkübatörü dekontamine etmek ve temiz bir dondurulmuş stoktan yeniden başlamak.
→Hücre Kültüründe Endotoksin Testi
Endotoksin testi, laboratuvar suyunda, besiyerinde, serumlarda ve reaktiflerde bulunan bakteriyel lipopolisakkariti (LPS) ölçer; sonuç mililitre başına endotoksin ünitesi (EU/mL) olarak bildirilir ve 1 EU, referans standart E. coli endotoksininin yaklaşık 0,1-0,2 ng'ına karşılık gelir. Farmakope yöntemleri, USP <85> kapsamındaki jel-pıhtı, türbidimetrik ve kromojenik biçimleriyle LAL (limulus amebosit lizatı) testi ile USP <86> kapsamındaki hayvansal kaynak içermeyen rekombinant Faktör C (rFC) testidir; kinetik formatlar yaklaşık 0,001-0,005 EU/mL düzeyine kadar nicel ölçüm yapar. Hücre kültüründe pratik limitler su için 0,25 EU/mL, hücre kültürü kalitesindeki reaktiflerin çoğu için ≤1 EU/mL ve fetal sığır serumu için genel sektör standardı olarak ≤10 EU/mL'dir; düşük endotoksinli kaliteler ≤1 EU/mL, ultra düşük kaliteler ise 0,1 EU/mL'nin altındadır. Endotoksin otoklavlamadan sağ çıkar ve 0,2 µm filtrelerden geçer; bu nedenle sonradan uzaklaştırılmak yerine kaynağında dışarıda bırakılmalıdır.
→Hücre Kültüründe Mikoplazma Testi
Mikoplazma testi, laboratuvar hücre kültürlerini bulanıklık, pH değişimi ya da başka herhangi bir görünür iz bırakmadan kontamine eden Mollicutes türlerini saptar; bir kültürün mL başına 10⁷–10⁸ organizma taşırken bile sapasağlam görünmesinin nedeni budur. Pratikte kullanılan yöntemler şunlardır: PCR ya da qPCR (kabaca 1–10 CFU/mL, sonuç aynı gün), enzimatik lüminesans testleri (yaklaşık 20 dakika, orta düzey duyarlılık), bir indikatör hücre hattı üzerinde okunan floresan DNA boyama (zenginleştirme basamağının kullanılıp kullanılmamasına göre yaklaşık 10²–10⁶ CFU/mL) ve hâlâ referans yöntem sayılan ama 28 güne kadar süren doğrudan sıvı besiyeri ve agar kültürü. Kültürleri geldiklerinde, karantinadan sonra ve ardından en az ayda bir test edin; doğrulanmış bir pozitif normalde tedavi edilmez — atılır ve temiz bir dondurulmuş stoktan yeniden başlatılır.
→