Yoğunluk Gradyanı Ortamı Olarak İyodiksanol

İyodiksanol (CAS 92339-11-2, molekül ağırlığı 1550,2), hidroksillenmiş bir propil köprüsüyle birleştirilmiş iki üç-iyotlu benzen halkasından ve çok sayıda dihidroksipropil sübstitüentinden kurulu, iyonik olmayan ve suda çok iyi çözünen bir bileşiktir. İyonik olmayan iyotlu röntgen kontrast maddeleriyle aynı kimyasal aileye aittir; molekül tasarımının kaynağı da budur: bu bileşikler yoğun, aşırı çözünür, iyonik olmayan ve biyolojik olarak iyi tolere edilen maddeler olacak şekilde tasarlanmıştır ve iyi bir yoğunluk gradyanı ortamının ihtiyaç duyduğu özellikler tam olarak bunlardır.

Laboratuvar kullanımı için steril %60 (w/v) sulu çözelti olarak sunulur — OptiPrep adıyla ve başka tedarikçilerce %60 iyodiksanol çözeltisi olarak satılan format. Temel teknik özellikler şunlardır:

• Yoğunluk: 20 °C'de 1,32 g/mL
• Ozmolalite: yaklaşık 290 mOsm/kg
• İyonik değildir, dolayısıyla iyonik şiddete neredeyse hiç katkı vermez
• Sterildir ve endotoksini denetlenmiştir
• Metabolik olarak inerttir ve çalışma derişimlerinde hücrelere toksik değildir

İzoozmotik olması işin bütün özüdür. Bir sükroz gradyanında 1,25 g/mL yoğunluğa ulaşmak, fizyolojik değerin birkaç yüz miliozmol üzerinde — tipik olarak 1000 mOsm/kg'ın hayli üstünde — bir çözelti gerektirir. Bu çözeltiye konan, membranı olan her şey su kaybeder ve büzüşür; bu da yüzdürme yoğunluğunu değiştirir, morfolojisini bozar ve hücrelerle organeller söz konusu olduğunda onlara zarar verir. İyodiksanol aynı yoğunluklara kabaca fizyolojik ozmolalitede ulaşır, çünkü molekül büyük ve ağırdır: çözünmüş her bir parçacık başına çok sayıda gram kütle elde edersiniz. Tek bir 1550 Da'lık molekül, tek bir 342 Da'lık sükroz molekülüyle aynı ozmotik basıncı üretir, ama dört buçuk katı kütle taşır.

Pratik sonuç şudur: bir parçacığın iyodiksanol gradyanındaki konumu, koşu sırasında suyunu kaybederek edindiği bir yoğunluğu değil, gerçek hidratlı yüzdürme yoğunluğunu yansıtır. Nicel çalışmalarda — dolu ve boş AAV kapsitlerini karşılaştırmak, hücre dışı vezikül alt gruplarını tanımlamak, organel yoğunluğunu ölçmek — bu küçük bir kolaylık değil, anlamlı sonuçla yanıltıcı sonuç arasındaki farktır.

%60'lık stok su temellidir ve tuz ya da tampon içermez. Biyolojik malzemede doğrudan kullanmak, örneği iyonik desteği olmayan bir çözeltiye maruz bırakır; bu yüzden önce bir çalışma çözeltisine dönüştürülür ya da doğrudan seçilen bir tampon içine seyreltilir.

Klasik çalışma çözeltisi. 5 hacim %60 iyodiksanolü 1 hacim 6x seyrelticiyle karıştırın — tipik olarak %0,85 NaCl ve 60 mM Tricine-NaOH, pH 7,4 ya da eşdeğer bir derişik tampon. Bu, izotonik ve tamponlanmış, yoğunluğu yaklaşık 1,27 g/mL olan %50 (w/v) iyodiksanol çalışma çözeltisini verir. Sonraki tüm seyreltmeler bu çalışma çözeltisinden 1x seyrelticiyle (%0,85 NaCl, 10 mM Tricine-NaOH pH 7,4) yapılır; böylece gradyanın tamamında iyonik şiddet ve pH sabit kalır, yalnızca iyodiksanol derişimi — dolayısıyla yoğunluk — değişir.

İyodiksanol gradyanlarını uslu kılan şey, tamponu sabit tutan bu ilkedir. Tek bir parametreyi değiştirin, geri kalan her şeyi sabit tutun.

Doğrudan uygulama tamponuna seyreltme. Virüs çalışmalarında klasik çalışma çözeltisini atlayıp %60'lık stoku doğrudan sürecin kullandığı tampona seyreltmek yaygındır; bu genellikle PBS-MK'dır (1 mM MgCl2 ve 2,5 mM KCl içeren fosfat tamponlu tuzlu su). Standart AAV protokolünün yaptığı da budur.

Seyreltme hesabı. %60'lık stoktan, %C derişiminde V hacminde çözelti hazırlamak için:

%60 stok hacmi = V x C / 60 Seyreltici hacmi = V - (V x C / 60)

Örneğin 10 mL %40 iyodiksanol için 10 x 40/60 = 6,7 mL %60 stok ve 3,3 mL seyreltici gerekir.

Pratik kullanım. %60'lık çözelti belirgin biçimde viskozdur; bu yüzden yavaş pipetleyin ve uçların tamamen boşalmasını bekleyin — özensiz pipetleme, gradyan bileşiminde gerçek bir hata kaynağıdır. Viskozite sıcaklıkla hızla düştüğünden kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. Oda sıcaklığında, ışıktan korunarak saklayın; dondurmayın. İyodiksanol çözeltileri uzun süre kararlıdır, ancak sonraki ürünün steril olması gerekiyorsa steril tutulmalıdır.

Görsel belirteç olarak fenol kırmızısı eklemek kendini fazlasıyla amorti eden küçük bir hiledir. Standart AAV gradyanında fenol kırmızısı %25 ve %60'lık tabakalara eklenir; böylece tamamlanmış gradyanda görünür renkli ve renksiz bantlar oluşur, arayüzler belirgin hâle gelir ve tabakalamanın temiz yapılıp yapılmadığını, gradyanın rotora taşınırken bozulup bozulmadığını anında görebilirsiniz.

Zolotukhin ve arkadaşlarının 1999'da tanıttığı dört basamaklı iyodiksanol gradyanı, ham hücre lizatından rekombinant AAV saflaştırmanın standart laboratuvar yöntemi olmayı sürdürüyor ve insanların iyodiksanolü aramasının en yaygın tek nedeni bu.

Neden işe yarar. Paketlenmiş genom taşıyan AAV kapsitleri, DNA yoğun olduğu için boş kapsitlerden daha yoğundur. Bu farka göre ayarlanmış bir gradyan, dolu kapsitleri boş olanlardan ayırırken aynı anda hücresel proteinin ve nükleik asidin büyük kısmını geride bırakır.

Gradyan bileşimi. Kapatılabilir bir ultrasantrifüj tüpüne, en yoğun olan altta kalacak biçimde tabakalanır; böylece örnek en üstte oturur:

%15'lik basamaktaki 1 M NaCl tesadüfi değildir — virüs bu tabakadan geçerken kapsit yüzeyine elektrostatik bağlanmış konak proteinini ve nükleik asidi sıyırma işini yapar. Bunun atlanması saflığı belirgin biçimde düşürür.

Santrifüjleme. Type 70 Ti gibi sabit açılı bir rotorda 10 °C'de 90 dakika boyunca 350.000 x g standart bir koşuldur; 18 °C'de 2 saat boyunca 200.000 x g eşdeğer bir alternatiftir. Tüplerin tamamen dolu olması gerektiğinden QuickSeal tipi kapatılabilir tüpler kullanılır.

Toplama. %40'lık tabakadan, %40-60 arayüzünün hemen altından çekerek toplayın. Dolu kapsitler %40'lık basamağın dibinde yoğunlaşır. Tüpün yan duvarını arayüzün hemen altından bir iğneyle delin ve yavaşça çekin; %40'lık tabakayı alırken, boş kapsitlerle artık proteinin biriktiği üstteki %25-40 arayüzünden kaçının. Fazla yukarıdan toplamak, boş kapsitleri son ürüne taşımanın en yaygın yoludur.

Ne beklemeli. İyodiksanolle saflaştırılmış preparatlar ortalama olarak genellikle hâlâ yaklaşık %20 boş parçacık içerir. Gradyan güçlü bir zenginleştirme basamağıdır, mutlak bir ayrım değil. Çok düşük bir boş kapsit oranı gerektiğinde iyodiksanolü genellikle anyon değişim kromatografisi gibi dik açılı bir basamak izler ya da yerini analitik saflıkta sezyum klorür bantlaması alır; birincisi verimden, ikincisi kapsit bütünlüğünden ödün verir.

İyodiksanolün uzaklaştırılması. İyodiksanol, sonraki uygulamaların çoğundan — özellikle in vivo her türlü çalışmadan ve viskoziteye ya da kırılma indisine duyarlı her testten — önce uzaklaştırılmalıdır. Diyaliz, tuz giderme kolonu, santrifüjlü konsantratör veya teğetsel akış filtrasyonuyla tampon değişiminin hepsi işe yarar. Yalnızca seyreltmenin yeterli olduğunu varsaymayın — kalıntı iyodiksanol, protein miktar tayinini ve bazı titrasyon yöntemlerini bozar.

Hücre ayrımı. İyodiksanol, hem yoğunluk bariyeri hem de sürekli gradyan temelli hücre ayrımlarını fizyolojik ozmolalitede destekler; bu amaçla geleneksel olarak kullanılan polisükroz-diatrizoat ortamlarına göre başlıca üstünlüğü budur. Kan hücresi ayrımları iyi yerleşmiş yoğunluk eşiklerine dayanır — mononükleer hücreler geleneksel olarak 1,077 g/mL'lik bir bariyerin üzerinden toplanırken granülositler ve eritrositler bu bariyerin içinden geçip çöker. İyodiksanol basit bir seyreltmeyle istenen herhangi bir yoğunluğa ayarlanabilir ve izoozmotik olduğu için hücreler ayrım sırasında su kaybetmez; dolayısıyla koşu sırasındaki yoğunlukları gerçek yoğunluklarıdır.

Hücreler için örneği bariyerin üzerine yavaşça tabakalayın, salınımlı kova rotoru kullanın ve yavaşlama sırasında arayüzün bozulmaması için freni kapalı ya da en düşük ayarda santrifüjleyin. Arayüzden toplayın, tamponla seyreltin ve gradyan ortamını uzaklaştırmak için yıkayın.

Hücre altı fraksiyonlama. İyodiksanol mitokondri, lizozom, peroksizom, endoplazmik retikulum, Golgi ve plazma membranı fraksiyonlarını ayırır; özellikle yoğunlukları birbirine yakın organeller için değerlidir, çünkü sükroz gradyanları ozmotik su kaybıyla bu organelleri farklı derecelerde bozar. Hem önceden hazırlanmış basamaklı veya sürekli gradyanlar hem de kendiliğinden oluşan gradyanlar kullanılır — düzgün dağılımlı bir çözelti dikey veya dikeye yakın bir rotorda yüksek hızda santrifüjlendiğinde iyodiksanol gradyanı yerinde oluşturur; bu da elle tabakalama adımını ortadan kaldırır ve koşular arası tekrarlanabilirliği artırır.

Hücre dışı veziküller. Yoğunluk gradyanı flotasyonu, hücre dışı vezikülleri, birlikte izole olan protein agregatları ve lipoproteinlerden ayırmanın referans yöntemi hâline geldi; ultrasantrifüjlemeyle çöktürmeye dayanan yöntemler bu ayrımı yapamaz. Tipik bir yaklaşımda ham vezikül preparatı, tüpün dibine yoğun bir iyodiksanol tabakası içinde yüklenir ve veziküllerin uzun bir koşu boyunca daha düşük yoğunluklu basamaklardan oluşan bir gradyanın içinde yukarı yüzmesi sağlanır — örneğin %40, %20, %10 ve %5. Çöktürmek yerine yüzdürmek bilinçli bir tercihtir: protein agregatları yoğundur ve geride kalır, membranla çevrili veziküller ise kendi yüzdürme yoğunluklarına yükselir. Küçük hücre dışı veziküller tipik olarak 1,08-1,19 g/mL bölgesinde bantlanır; ancak kesin değer kaynak malzemeye bağlıdır ve varsayılmak yerine, toplanan fraksiyonların kırılma indisi ölçülerek kendi sisteminiz için belirlenmelidir.

Diğer virüsler. AAV için kullanılan ilkelerin aynısı lentivirüs, adenovirüs, influenza ve daha pek çok virüs için de geçerlidir; basamak yüzdeleri söz konusu parçacığın yüzdürme yoğunluğunu kuşatacak biçimde ayarlanır. İyodiksanol, zarflı virüslere genellikle sükroz veya sezyum klorürden daha naziktir; bu ikisi zarfları sıyırıp enfeksiyöz titreyi düşürebilir.

İyodiksanolü şu durumlarda kullanın: fizyolojik ozmolalite gerekiyorsa, sağlam hücreler, organeller, zarflı virüsler veya veziküllerle çalışıyorsanız, anlamlı yüzdürme yoğunlukları istiyorsanız ya da büyük hacimlere karşı diyalize gerek kalmadan basit tampon değişimiyle uzaklaştırılabilen bir ortama ihtiyacınız varsa.

Sükroz ucuz, tanıdık ve ozmotik olarak duyarsız, dayanıklı malzeme için tümüyle yeterlidir. Sorunu ozmotiktir: yüksek yoğunluklu sükroz çözeltileri güçlü hipertoniktir, membranı olan her şeyi su kaybına uğratır, görünür yoğunlukları kaydırır ve zarflı virüslerle organellere zarar verir. Ayrıca yüksek derişimde viskozdur, bu da koşuları uzatır.

Sezyum klorür, iyonik olmayan hiçbir ortamın ulaşamayacağı kadar yüksek yoğunluklara — yaklaşık 1,9 g/mL'ye kadar — çıkar ve nükleik asitler ile dolu/boş AAV kapsitlerinin ayrımında mükemmel çözünürlük sağlar. Bedeli ağırdır: çok yüksek iyonik şiddet, uzayan koşu süreleri, tuzu uzaklaştırmak için zorunlu diyaliz ve iyodiksanole kıyasla belgelenmiş AAV enfektivite kaybı. Alanın preparatif çalışmalarda iyodiksanole geçip CsCl'yi analitik uygulamalar için elde tutmasının nedeni tam olarak budur.

Percoll, polivinilpirolidonla kaplanmış kolloidal bir silika süspansiyonudur. Tuzlarla ayarlandığında izoozmotiktir ve hücre ile organel ayrımlarında çok iyidir; ancak azami çalışma yoğunluğu yaklaşık 1,13 g/mL ile sınırlıdır, bu da virüslerin çoğunu erişim dışında bırakır. Gerçek bir çözelti değil partiküllü bir kolloit olduğundan üründen uzaklaştırılmalıdır ve preparatın partiküllere duyarlı bir analitik yönteme gireceği durumlarda uygun değildir.

Polisükroz-sodyum diatrizoat ortamları (Ficoll-Paque ailesi), 1,077 g/mL'lik bir bariyerde periferik kan mononükleer hücre izolasyonunun geleneksel tercihidir. Bu belirli iş için iyi doğrulanmışlardır ve hâlâ yaygın biçimde kullanılırlar; ancak keyfi yoğunluklar kurmakta iyodiksanol kadar esnek değillerdir ve aralıklarının tamamında izoozmotik değillerdir.

Nycodenz, iyodiksanolden önce gelen ve iyonik olmayan iyotlu monomer olan ortamdır; yüksek yoğunluğa ulaşır, ama kabaca 1,15 g/mL'nin üzerinde hiperozmotik hâle gelir. İyodiksanol tam da bu sınırlamayı gidermek için dimer olarak geliştirildi; yüksek yoğunluklu uygulamaların çoğunda Nycodenz'in yerini almasının nedeni budur.

Tabakalamayı ya hep alttan üste ya hep üstten alta, tutarlı biçimde yapın. Ya uzun bir kanülle yoğun çözeltileri hafif olanların altına verin, ya da hafif çözeltileri tüp duvarından yoğun olanların üzerine nazikçe tabakalayın. Tek bir gradyan içinde yöntem karıştırmak arayüzleri bozar. Ne kurduğunuzu görebilmek için ardışık basamaklara fenol kırmızısı koyun.

Kapatılabilir tüpleri tamamen doldurun. Bu hızlarda sabit açılı rotorlarda kullanılan ultrasantrifüj tüpleri dolu olmalıdır, aksi hâlde çökerler. Asgari dolum için rotor kılavuzuna bakın.

Rotor toleransı içinde dengeleyin. 350.000 x g'de bir dengesizlik küçük bir mesele değildir.

Gradyanların gevşemesine izin verin, ama fazla değil. Önceden hazırlanmış basamaklı gradyanlar keskin arayüzleri yumuşatmak için kısa süre bekletilebilir; ancak saatlerce bırakılan bir gradyan difüzyonla tasarlamadığınız bir şeye dönüşür.

Yavaşlama. Bir arayüzün duruştan sağ çıkması gereken her durumda freni kapalı ya da en düşük ayarda kullanın. Bu özellikle hücre ayrımları için geçerlidir.

Haritaya güvenmek yerine fraksiyonları ölçün. Sonuç önemliyse fraksiyonları toplayın ve gerçek yoğunluk profilini belirlemek için her birinin kırılma indisini ölçün, sonra malzemenizin konumunu gerçek bir sayıyla ilişkilendirin. Gradyanlar her zaman tasarlandığı gibi oluşmaz ve kırılma indisi ölçümü yalnızca birkaç dakika sürer.

Sık karşılaşılan sorunlar:

• Malzeme bantlanmak yerine birçok fraksiyona yayılmış. Genellikle koşu süresi yetersizdir ya da gradyanın yoğunluk aralığı fazla geniştir. Aralığı beklenen yoğunluğun çevresinde daraltın ve koşuyu uzatın.
• Hiçbir şey beklenen yerde bantlanmıyor. Başka bir şeyi değiştirmeden önce gerçek gradyanı kırılma indisiyle doğrulayın. Ayrıca örneğin doğru konumdan yüklenip yüklenmediğini kontrol edin — flotasyon ve sedimentasyon yaklaşımları tüpün karşıt uçlarından yükleme yapar.
• AAV saflığı düşük. %15'lik basamağın 1 M NaCl içerdiğini doğrulayın ve toplamayı nereden yaptığınızı kontrol edin — %40'lık tabakada fazla yukarıdan almak boş kapsitleri beraberinde taşır.
• Düşük geri kazanım. İyodiksanol viskozdur; yavaş ve dikkatli toplama önemlidir. Ayrıca malzemenin tampon değişiminden önce uzun süre gradyan ortamında bırakılmadığını doğrulayın.
• Sonraki testler beklenmedik davranıyor. Kalıntı iyodiksanol, protein miktar tayinini ve kırılma indisi temelli yöntemleri bozar. Ölçüm yapmadan önce tampon değişimini tamamlayın.