Hücre Kültürü Kontaminasyonu

Hücre kültürü kontaminasyonunu iki gruba ayırmakta fayda var, çünkü laboratuvarda tamamen farklı davranışlar gerektiriyorlar.

Görünür grup — bakteriler, mayalar ve filamentli mantarlar — hızlı ürer, besiyerini değiştirir ve bir ila beş gün içinde belli olur. Bunları bakarak bulursunuz. Can sıkıcıdırlar ama kendilerini ele verirler; burada sorulacak yararlı soru “bu nedir” değil, “nereden girdi” sorusudur, çünkü cevap neredeyse her zaman aseptik teknikte belirli ve düzeltilebilir bir açıktır.

Görünmez grup — mikoplazma, viral kontaminasyon ve yanlış tanımlanmış bir hücre hattıyla çapraz kontaminasyon — ne bulanıklık, ne renk değişimi, ne de gözle görülebilecek başka bir iz bırakır. Bunlar yalnızca bilinçli test ile bulunur ve tam da sessiz oldukları için sonuçlarınıza çok daha fazla zarar verirler. Yanlış tanımlanmış ya da mikoplazma pozitif bir hat, temiz görünen ve tekrarlanabilir veriler üretmeye devam eder — ama yanlış bir konu hakkında.

Adını anmaya değer yedinci bir kategori daha var: kimyasal kontaminasyon — endotoksin, deterjan kalıntısı, hortumdan sızan plastikleştirici, metal iyonları ya da spesifikasyon dışı bir besiyeri bileşeni. Bir organizma değildir, görünmezdir ve çoğunlukla “hücrelerin keyfi yok” diye açıklanan belirtilerin tam olarak kendisini üretir: yavaş üreme, zayıf tutunma, konflüensiye ulaşamama.

Görünüm. Besiyeri, bulaşma olayından genellikle 24–72 saat içinde bulanıklaşır. Besiyerinde fenol kırmızısı varsa, yoğun bir aerobik veya fakültatif popülasyon pH'ı düşürür ve besiyerini kırmızı-turuncudan sarıya çevirir. Faz kontrast altında 200–400× büyütmede bakteriler çok küçük çubuklar, koklar ya da kokobasiller olarak görünür; tipik olarak 0,5–1 µm kalınlığında ve yaklaşık 20 µm uzunluğa kadar olup hücreler arasında belirgin bir Brown hareketiyle, hareketli türlerde ise yönlü hareketle dolaşırlar. Yapışkan hücreler arasında dün orada olmayan, titreşen granüler bir zemin klasik ilk işarettir.

Sık görülen kaynaklar. Operatör tekniği — eller, kol ağızları, açık kapların üzerinde konuşmak, sterilize edilmemiş bir malzemeyi açık bir flaskın üzerinden geçirmek. Kontamine su banyoları ve inkübatör su tepsileri. Filtrelenmemiş ya da hatalı filtrelenmiş takviyeler. Birden fazla hatta ortak kullanılan kontamine bir stok şişesi.

Müdahale. Atın. Kabı kabinden çıkarmadan önce otoklavlayın veya dezenfekte edin. Bakteriyel olarak kontamine olmuş bir flaskı antibiyotikle kurtarmaya çalışmayın: görünür üreme baskılansa bile düşük düzeyde canlı kalanlar ve endotoksin yükü sürer; böylece bariz bir sorunu gizli bir soruna dönüştürmüş olursunuz.

Görünüm. Maya mikroskop altında ayrı ayrı duran oval ya da küresel partiküller olarak görünür; tipik olarak 3–5 µm boyutundadır, yani bakterilerden gözle seçilebilecek kadar büyüktür ve çoğu zaman görünür biçimde tomurcuklanır — büyük bir ana hücreye tutunmuş küçük bir yavru hücre. Tomurcuklanma, tanımada en işe yarayan tek özelliktir.

Besiyeri bulanıklaşır, ama bunu genellikle bakterilere göre daha yavaş yapar ve çoğu zaman ancak kontaminasyon iyice yerleştikten sonra. pH davranışı ayırt edicidir ve bilinmeye değer: maya kontaminasyon ağırlaşana kadar pH'ı pek değiştirmez, ağırlaştığında ise pH tipik olarak düşmek yerine yükselir. Bulanıklaşmışken fenol kırmızısı sarıya değil de pembe-mora dönmüş bir kültürün maya olma ihtimali bakteriden yüksektir.

Sık görülen kaynaklar. Hava kaynaklı — mayalar genel ortamda bol bulunur; dolayısıyla hava akışı bozulmuş bir kabin, bakımsız bir HEPA filtresi ya da kabin dışında yapılan çalışma alışılmış açıklamadır. Deri ve saç. Kontamine su banyoları.

Müdahale. Atın. Sonra kabini kontrol edin: hava akışını sertifikalandırın, filtreyi kontrol edin ve kimsenin camı yanlış yükseklikte tutarak çalışmadığından emin olun.

Görünüm. Filamentli mantarlar bütün kontaminantlar içinde gözle en belirgin olanlarıdır. Mikroskop altında miselyum, görüş alanını kat eden ince, tüy gibi dallanan filamentler (hifler) olarak görünür; yer yer daha yoğun spor kümeleri eşlik eder. Çıplak gözle kontaminasyon, besiyerinde yüzen ya da sıvı yüzeyinde flask duvarına tutunmuş küçük beyaz, sarı, gri veya siyah tüylü noktalar olarak başlar ve birkaç gün içinde büyük tüylü yamalara dönüşür. Besiyeri çoğu zaman bakterilere göre daha uzun süre berrak kalır ve kültür ilerledikçe pH hafifçe yükselebilir.

Flaskta tarif edilen “iplik iplik” ya da “pamuk yumağı” görünümü neredeyse her zaman filamentli mantardır.

Sık görülen kaynaklar. Hava kaynaklı sporlar — mantar sporları dayanıklıdır, her yerde bulunur ve yüzeylerde uzun süre canlı kalır. İnşaat işleri, rutubet, bakımsız inkübatörler (su tepsisi klasik bir rezervuardır) ve kontamine inkübatör rafları. Kültür odasına sokulan karton ambalaj, hakkı yenen bir kaynaktır.

Müdahale. Atın ve olayı flask düzeyinde değil, inkübatör düzeyinde bir olay olarak ele alın. İnkübatörü boşaltın, rafları ve su tepsisini çıkarıp otoklavlayın, inkübatörün dekontaminasyon döngüsünü çalıştırın ya da onaylı bir sporisit ile silin, su tepsisinin içeriğini onaylı bir mantar önleyici su katkısı içeren taze steril suyla değiştirin. Bir inkübatörü kolonize etmiş mantar sporları, inkübatörün kendisi temizlenene kadar yeni kültürleri yeniden enfekte etmeyi sürdürür.

Görünüm. Yok. Bütün sorun da bu. Mikoplazma mL başına 10⁷–10⁸ organizmaya ulaşır; ne bulanıklık, ne görünür bir pH değişimi, ne de rutin bir invert mikroskopta saptanabilecek herhangi bir şey. Hücre duvarı olmayan ve 0,3–0,8 µm boyutundaki bu organizmalar 0,2 µm filtrelerden geçer ve doğaları gereği penisiline dirençlidir.

Dolaylı işaretler özgül değildir ve kolayca başka nedenlere yorulur: üremenin giderek yavaşlaması, doygunluk yoğunluğunun düşmesi, besiyerinin beklenenden hızlı tükenmesi, transfeksiyon veriminin gerilemesi, ilaç yanıtının kayması. Bunlardan herhangi biri, serum partisini değiştirmeyi değil, test yapmayı gerektirir.

Sık görülen kaynaklar. Aynı laboratuvardaki diğer kontamine kültürler — aerosol ve ortak şişeler yoluyla yayılır; laboratuvar personeli, çünkü kontaminasyona yol açan türlerin birkaçı insan ağız florasının doğal üyesidir; tarihsel olarak önemli olan ama bugün payı çok azalmış hayvansal kaynaklı serum ve tripsin; ve koleksiyon dışı kaynaklardan gelen hücre hatları.

Müdahale. İkinci bir yöntemle doğrulayın, karantinaya alın ve normalde atın — temiz bir dondurulmuş stoktan yeniden başlamak, tedaviden hem daha hızlı hem de daha savunulabilirdir. Saptama yöntemlerinin tam karşılaştırması, test sıklığı ve “yok etmek mi atmak mı” kararı mikoplazma testi referansında ele alınmıştır.

Görünüm. Üretici kültürde genellikle yoktur. Birçok virüs konak hücre hattında sitopatik etki yaratmadan çoğalır; dolayısıyla kültür normal görünür ve normal ürer. Sitopatik etkinin ortaya çıktığı durumlarda ise yuvarlaklaşma, yüzeyden kalkma, sinsityum oluşumu ya da tek tabakada plak benzeri açılmalar görülür; bunları aşırı konflüensiyle veya kötü bir tripsinizasyonla karıştırmak kolaydır.

Neden önemli. Viral kontaminasyon rutin araştırma kültürlerinde nadiren sorun olur; ancak biyolojik ilaç ya da hücresel tedavi üretimine yönelik her materyal için ciddi bir sorundur ve kaynak materyal insan veya primat kökenli olduğunda laboratuvar biyogüvenliği açısından da dikkate alınması gerekir.

Sık görülen kaynaklar. Orijinal doku ya da donör materyali; başta serum ve tripsin olmak üzere hayvansal kaynaklı hammaddeler; ve tesisteki diğer kültürler.

Müdahale. Viral test uzmanlık işidir — belirli etkenler için PCR panelleri ve geniş tarama için indikatör hücre hatları üzerinde in vitro rastlantısal etken testleri. Rutin araştırmada pratik kontrol önlemedir: virüs tarama verilerini yayımlayan tedarikçilerden serum ve tripsin kullanın ya da bu yolu tümüyle ortadan kaldıran, hayvansal kaynak içermeyen (ADCF) reaktifleri ve rekombinant ayrıştırma enzimlerini tercih edin.

Hücre biyolojisinde sonuçları en ağır olan kontaminasyon aslında bir organizma bile değildir: bir hücre hattının bir diğerini bastırarak çoğalması ya da geçmişinin bir noktasında yanlış etiketlenmiş olmasıdır.

Geniş ölçekli kimlik doğrulama taramaları, aktif olarak kullanılan hücre hatlarının azımsanmayacak bir bölümünün etiketinde yazan hat olmadığını defalarca göstermiştir. En bilinen suçlu HeLa'dır — hızlı üreyen, dayanıklı ve tarihsel olarak birçok başka hattın yerini almaktan sorumlu bir hat — ama güçlü üreyen herhangi bir hat, bir kez karıştığında daha yavaş olanı bastırır.

Görünüm. Yok; ya da morfolojide, üreme hızında veya belirteç ifadesinde, pasaj sayısına yorulması kolay yavaş bir kayma.

Kaynaklar. Kabinde aynı anda iki hatla çalışmak. Ortak besiyeri şişeleri. Yanlış etiketlenmiş viyaller. Kötü tutulmuş dondurucu kayıtları. Kendi zinciri bilinmeyen bir meslektaştan hat almak.

Müdahale ve önleme. İnsan hatları için standart kimlik doğrulama yöntemi kısa ardışık tekrar (STR) profillemesidir; fare hatları için de murin STR panelleri vardır. Bir hattı teslim aldığınızda, bankaladığınızda ve sonrasında düzenli aralıklarla profilleyin. Kabinde asla aynı anda iki hücre hattı açık bulundurmayın. İki hat arasında asla ortak besiyeri şişesi kullanmayın. Dergilerin çoğu artık STR ile doğrulanmış bir kimlik beyanı istiyor ve bir profillemenin bedeli, tekrarlanan bir deneyin bedeli yanında yok denecek kadar küçüktür.

Yanlış görünen her şey canlı değildir. Bir kültürü atmadan önce biyolojik olmayan açıklamaları eleyin:

• Endotoksin — sudan, serumdan ya da hammaddelerden gelir; bağışıklık yetkin hücreleri uyarır, üremeyi ve farklılaşmayı hiçbir görünür iz bırakmadan değiştirir. Isıya dayanıklıdır, otoklavdan sağ çıkar ve 0,2 µm filtrasyonla uzaklaştırılamaz.
• Deterjan veya dezenfektan kalıntısı — cam malzemede ya da iyi durulanmamış bir kabin yüzeyinde.
• Plastikleştirici ya da ekstrakte olabilen madde sızması — hortumlardan, saklama şişelerinden veya doku kültürü sınıfı olmayan plastiklerden.
• Çökeltiler — kalsiyum fosfat kristalleri, çökmüş serum proteini ya da soğukta saklama sonrası kristalleşmiş besiyeri bileşenleri — mikroskop altında partiküllü bir kontaminasyona benzer, ancak ışığı kırar, geometriktir, kendiliğinden hareket etmez ve gözlemler arasında çoğalmaz. Dört saat sonra yeniden bakın: kontaminasyon çoğalır, çökelti çoğalmaz.
• Hücre artıkları ve apoptotik cisimcikler — stres altındaki ya da aşırı konflüent bir kültürden gelir ve düşük büyütmede bakteriyel kontaminasyona benzeyebilir. Büyütmeyi artırmak konuyu genellikle çözer.

Kabaca, harcanan çaba başına önledikleri kontaminasyon miktarına göre sıralanmıştır:

1. Aseptik teknik ve kabin disiplini. Camı doğru yükseklikte tutarak çalışın, elleri ve malzemeleri kritik açıklıkların hava akımına göre aşağısında tutun, açık bir kabın üzerinden asla bir şey geçirmeyin, kabine giren her malzemeyi %70 etanolle silin ve kabinin içine doğru konuşmayın. Tek başına bu madde kontaminasyonun büyük kısmını önler.
2. Aynı anda tek hat, her hatta kendi şişesi. Çapraz kontaminasyonu ve mikrobiyal yatay yayılımın çoğunu tek hamlede ortadan kaldırır.
3. Gelen kültürleri karantinaya alın — test edilene kadar ayrı bir inkübatörde tutun.
4. İnkübatörün bakımını yapın. Haftada bir onaylı katkıyla su tepsisi değişimi, ayda bir silme, planlı dekontaminasyon döngüsü ve üreticinin öngördüğü aralıkta HEPA filtre değişimi.
5. Kabini yılda bir sertifikalandırın ve hava akışı alarmının çalıştığını doğrulayın.
6. Erken bankalayın, temiz bankalayın ve bankayı test edin. Düşük pasajda test edilmiş bir ana banka, bir kontaminasyon olayını bir öğleden sonralık aksamaya indirger.
7. Yukarıdakilerin yerine koruyucu antibiyotik kullanmayın. Düşük düzeyli bakteriyel kontaminasyonu gizler; mikoplazmaya, mantarlara ya da çapraz kontaminasyona hiçbir etkisi yoktur ve laboratuvarların tekniklerinin bozulduğunu fark etmeyi bırakmasına yol açar.