MEM Alpha (α-MEM) ve Minimum Esansiyel Besiyeri

Harry Eagle, Minimum Esansiyel Besiyeri'ni 1959'da Science dergisinde yayımladı; bunu, bir memeli hücresinin kültürde gerçekte neye gereksinim duyduğunu yıllar boyunca sistemli biçimde belirledikten sonra yaptı. MEM bilinçli olarak asgaridir: on üç esansiyel amino asit, sekiz vitamin, glukoz ve Earle dengeli tuz çözeltisinin altı inorganik tuzu (kalsiyum klorür, potasyum klorür, magnezyum sülfat, sodyum klorür, sodyum fosfat ve sodyum bikarbonat). Başka hiçbir şey yok. Bu asgarilik zaten amacın kendisiydi — MEM'i, herhangi bir hücre tipinin gereksinimlerinin karşısında sınanabileceği tanımlı bir taban hâline getirdi.

Alfa-MEM ise 1971'de Clifford Stanners, Gerald Eliceiri ve Howard Green'in fare–hamster hibrit hücrelerinde ribozomlar üzerine çalışırken yayımladıkları "alfa modifikasyonu"dur. DMEM'in çok yüksek amino asit derişimlerine geçmeden, hibrit ve zor büyüyen hücreleri destekleyecek daha zengin bir besiyerine gereksinim duyuyorlardı. Yaptıkları değişiklik MEM'in tuz temelini ve glukozunu olduğu gibi bıraktı, üzerine besin maddeleri ekledi:

• Tüm esansiyel olmayan amino asitler — alanin, asparajin, aspartik asit, glutamik asit, glisin, prolin ve serin ile birlikte sistein
• Sodyum piruvat, 110 mg/L (1 mM)
• Askorbik asit (C vitamini) 50 mg/L, biyotin 0,1 mg/L, B12 vitamini yaklaşık 1,3 mg/L
• Lipoik asit 0,2 mg/L
• İsteğe bağlı olarak ribonükleozitler ve deoksiribonükleozitler

Ortaya çıkan besiyeri, MEM'den besin bakımından çok daha zengindir; buna karşılık onun iyonik bileşimini ve CO2 gereksinimini paylaşır. İkisi de "zenginleştirilmiş MEM" sayıldığı hâlde alfa-MEM'in DMEM'den farklı davranmasının nedeni budur.

Standart alfa-MEM formülasyonu (nükleozitli; nükleozit içermeyen versiyon, sekiz nükleozit dışında birebir aynıdır):

İnorganik tuzlar ve diğer bileşenler

Amino asitler (mg/L)

L-alanin 25; L-arjinin·HCl 126; L-asparajin·H2O 50; L-aspartik asit 30; L-sistein·HCl·H2O 100; L-sistin·2HCl 31; L-glutamik asit 75; glisin 50; L-histidin·HCl·H2O 42; L-izolösin 52; L-lösin 52; L-lizin·HCl 73; L-metiyonin 15; L-fenilalanin 32; L-prolin 40; L-serin 25; L-treonin 48; L-triptofan 10; L-tirozin (disodyum tuzu dihidrat olarak) 52; L-valin 46.

Vitaminler (mg/L)

Askorbik asit 50; i-inositol 2; kolin klorür 1; D-kalsiyum pantotenat 1; folik asit 1; niasinamid 1; piridoksal·HCl 1; tiamin·HCl 1; riboflavin 0,1; biyotin 0,1; B12 vitamini ~1,3.

Nükleozitler (mg/L, nükleozitli versiyonda)

Adenozin 10; sitidin 10; guanozin 10; üridin 10; timidin 10; 2'-deoksiadenozin 10; 2'-deoksiguanozin 10; 2'-deoksisitidin·HCl 11.

DMEM ile arasındaki iki karşıtlığı akılda tutmak gerekir. Alfa-MEM'in glukozu dörtte bir kadardır (1.000'e karşı 4.500 mg/L) ve bikarbonatı belirgin biçimde düşüktür (2.200'e karşı 3.700 mg/L; yani %10 değil %5 CO2). Buna karşılık besin yelpazesi daha geniştir — askorbat, biyotin, B12, lipoik asit ve esansiyel olmayan amino asitlerin tamamı; bunların hiçbiri DMEM'de yoktur. Alfa-MEM, zayıflatılmış bir DMEM değildir; bambaşka bir tasarımdır.

Alfa-MEM sipariş ederken verilecek en sonuç doğurucu tek karar budur ve yanlış verildiğinde seleksiyon deneylerini sessizce bozar.

Hücreler nükleotitleri iki yoldan üretir: purin ve pirimidinleri sıfırdan kuran, dihidrofolat redüktaz (DHFR) ile timidilat sentaza bağımlı de novo yolu ve HGPRT ile timidin kinaz gibi enzimleri kullanarak hazır nükleozitleri geri kazanan kurtarma yolu. Besiyerindeki nükleozitler kurtarma yolunu besler.

Kurtarma yolunun kapatılması gerektiğinde ya da seçim işaretiniz de novo sentez olduğunda nükleozit içermeyen alfa-MEM kullanın:

• CHO-DXB11 ve CHO-DG44 hatlarında DHFR temelli seleksiyon. Bu hatlar DHFR bakımından eksiktir ve nükleotitleri de novo üretemez. Yalnızca dışarıdan nükleozit verildiğinde yaşarlar; dolayısıyla nükleozit içermeyen alfa-MEM, DHFR taşıyan bir anlatım vektörünü almış hücreleri ayırt eden seçici baskının ta kendisidir. Nükleozit vermek seleksiyonu bütünüyle boşa çıkarır. Klasik kullanım budur ve nükleozit içermeyen alfa-MEM'in standart bir biyoüretim reaktifi olmasının nedeni de budur.
• Metotreksat amplifikasyonu. Mantık aynıdır: metotreksat DHFR'yi baskılar, besiyerindeki nükleozitler ise tam da elemek istediğiniz hücreleri kurtarır.
• Hibridoma çalışmalarında HAT ve HT seleksiyonu; burada amaç hangi yolun açık kalacağını denetlemektir.

Yalnızca zengin bir besiyeri istiyorsanız nükleozitli alfa-MEM kullanın: rutin mezenkimal stromal hücre çoğaltımı, kemik iliği kültürü, primer hücre büyümesi ve DHFR bakımından eksik hatların seleksiyon başlamadan önceki idamesi. Nükleozitler, nükleotit sentezinin metabolik yükünü azaltır ve zor büyüyen primer hücrelerin gelişimini genel olarak iyileştirir.

Protokolünüz nükleozitlerden hiç söz etmiyorsa ve seleksiyon yapmıyorsanız güvenli varsayılan, nükleozitli versiyondur. Protokolünüzde DHFR, metotreksat, HAT ya da HT geçiyorsa dikkatle okuyun — yanıt çoğunlukla "içermeyen" olur ve iki ürün, katalog adları tek bir sözcükle ayrıldığı için sıkça karıştırılır.

MEM iki ayrı tuz temeli üzerinde sunulur ve aradaki fark tümüyle kültürü nerede tutmayı düşündüğünüzle ilgilidir.

Earle dengeli tuzlarıyla hazırlanan MEM 2.200 mg/L sodyum bikarbonat içerir ve %5 CO2 inkübatörü için tasarlanmıştır. Standart laboratuvar biçimi budur; başka bir niteleme olmadan "MEM" denince kastedilen de budur. Alfa-MEM bu temeli kullanır.

Hanks dengeli tuzlarıyla hazırlanan MEM yalnızca yaklaşık 350 mg/L sodyum bikarbonat içerir ve kapalı kapta ya da atmosferik CO2 altında kullanılmak üzere tasarlanmıştır — tarihsel olarak doku taşınması, kapalı flask kültürü ve açık tezgâhta yapılan işlemler için. Hanks temelli MEM'i havalandırmalı bir flask içinde %5 CO2 inkübatörüne koyarsanız pH, tamponun kapasitesinin altına düşer.

Kural MEM'in ötesine genellenir: bikarbonat derişimi ile inkübatör CO2 düzeyi birbirine bağlı bir çifttir, çünkü bu besiyerlerinde pH'ı belirleyen şey bikarbonatın çözünmüş CO2'ye oranıdır. Bir veri sayfasında beklenmedik biçimde düşük bir bikarbonat değeri gördüğünüzde, ürünü inkübatöre koymadan önce Hanks temelli mi yoksa kapalı kap formülasyonu mu olduğunu denetleyin.

Mezenkimal stromal hücreler (MSC). Alfa-MEM, insan ve hayvan kaynaklı kemik iliği ile yağ dokusundan elde edilen MSC çoğaltımının standart temelidir; genellikle %10–20 FBS ya da tanımlı bir takviye ile kullanılır. Düşük glukozu burada bir avantajdır — yüksek glukozun MSC çoğalması ve farklılaşma potansiyeli üzerindeki etkileri belgelenmiştir.

Kemik ve kan yapıcı kültürler. Osteoblastlar, osteoklast farklılaşma deneyleri, kemik iliği stromal kültürleri ve uzun süreli ilik kültürleri geleneksel olarak alfa-MEM kullanır. İçerdiği askorbat osteoblast çalışmalarıyla doğrudan ilgilidir, çünkü kolajenin hidroksillenmesi ve matriks birikimi için askorbat gereklidir.

CHO-DXB11 ve CHO-DG44. Yukarıda anlatıldığı gibi, nükleozitli ve nükleozit içermeyen alfa-MEM ikilisi bu üretim hatlarında DHFR seleksiyonu ile metotreksat amplifikasyonunun standart eşleşmesidir.

Genel olarak primer hücreler. Kondrositler, diş pulpası hücreleri, keratinosit besleyici tabakaları, primer fibroblastlar ve daha birçok primer kültür; esansiyel olmayan amino asitler, piruvat, askorbat ve nükleozitler sayesinde alfa-MEM'de yalın MEM'e göre daha iyi gelişir.

Yalın MEM, asgari ve iyi tanımlı bir temelin istendiği yerlerde kullanılmayı sürdürür — Vero ve MRC-5 üzerinde viroloji ile aşı üretimi, plak deneyleri ve eklenen bileşenlerin sonucu bulandıracağı besin gereksinimi çalışmaları.

Kalsiyuma dikkat edin: alfa-MEM 1,8 mM içerir; bu, DMEM ile aynı düzeydir. Yapışkan (adherent) ve farklılaşan kültürlere uygundur, ama düşük kalsiyum isteyen keratinosit protokolleri için kötü bir temeldir.

CO2. Alfa-MEM'in 2.200 mg/L (26 mM) bikarbonatı %5 CO2 ile eşleşir. Bu, standart inkübatör ayarıdır; dolayısıyla alfa-MEM pH'ı, kutudan çıktığı hâliyle DMEM'e göre daha öngörülebilir biçimde korur.

Glutamin. Glutaminli formülasyonlarda 2 mM (292 mg/L). Çözeltide amonyağa bozunur; bu yüzden glutamin içermeyen besiyerine taze ekleme yapmak ya da kararlı dipeptit L-alanil-L-glutamin kullanmak uzun süreli kültürde daha tutarlı sonuç verir — kültürlerin haftalarca sürdüğü MSC çoğaltımında bu özellikle önemlidir.

Serum. Tipik oran %10 FBS'dir; MSC protokolleri sıklıkla %15–20 belirtir ve klinik düzeydeki çalışmalarda giderek daha çok tanımlı bir takviye ya da insan trombosit lizatı kullanılır.

Askorbat kararlılığı. Alfa-MEM'in 50 mg/L askorbik asidi gerçekten yararlıdır, ama gerçekten de kararsızdır — çözeltide günler ile haftalar içinde yükseltgenir. Askorbatın kolajen birikimini yönlendirdiği osteojenik farklılaşmada, bir aydır açık duran şişede kalanına güvenmek yerine taze askorbat-2-fosfat ekleyin. Askorbat-2-fosfat, tam da bu nedenle farklılaşma protokollerinde kullanılan kararlı biçimdir.

Saklama. Karanlıkta 2–8 °C'de, açılmamış hâlde tipik olarak 12–24 ay. Glutamin eklendikten sonra yaklaşık dört hafta. Alfa-MEM, askorbat, riboflavin ve folatın tamamı ışıkta bozunduğu için yalın MEM'den daha ışığa duyarlıdır. Kapalı bir buzdolabında tutun.

Toz alfa-MEM sodyum bikarbonatsız gelir; sulandırma sırasında 2,2 g/L ekleyin, filtrasyon sırasındaki yükselişi karşılamak için pH'ı hedefin yaklaşık 0,2 birim altına ayarlayın ve 0,22 µm'den steril filtrasyonla süzün.

Yanlış nükleozit versiyonunu sipariş etmek. İki ürün katalog adında tek sözcükle, DHFR ya da metotreksat seleksiyonundaki davranışta ise bütünüyle ayrılır. Raf etiketine değil, veri sayfasına bakın.

Alfa-MEM'i düşük glukozlu bir DMEM sanmak. Değildir. Bikarbonatı farklıdır (2.200'e karşı 3.700 mg/L), CO2 gereksinimi farklıdır, vitamin takımı farklıdır ve DMEM'de bulunmayan nükleozitleri, askorbatı, lipoik asidi ve piruvatı içerir.

Farklılaşma deneylerinde şişedeki askorbata güvenmek. Çözeltideki askorbik asit bozunur. Osteojenik çalışmalarda taze bir takviye olarak askorbat-2-fosfat kullanın.

Hanks tuzlu MEM'i CO2 inkübatörüne koymak. İçerdiği 350 mg/L bikarbonat %5 CO2'de tamponlama yapamaz ve kültür asitlenir.

MSC kültürlerini çalışmanın ortasında alfa-MEM ile DMEM arasında değiştirmek. Glukoz, kalsiyum ve mikrobesin içeriğinin üçü birden değişir; çoğalma hızı ile farklılaşma potansiyeli de onlarla birlikte kayar.