DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri)

DMEM, 1959'da Renato Dulbecco ve Gordon Freeman tarafından, polyoma virüsünün plak deneyleri için Harry Eagle'ın besiyerinde yapılmış bir değişiklik olarak tanımlandı. Değişiklik bilinçli olarak yalındı: Eagle'ın formülasyonunu alıp "amino asit ve vitaminlerin dört katı derişimini" kullanmak. Eagle'ın aynı yıl yayımlanan Minimal Esansiyel Besiyeri, bir memeli hücresinin kültürde gereksinim duyduğu asgari besin takımını çoktan ortaya koymuştu — on üç esansiyel amino asit, sekiz vitamin, glukoz ve Earle dengeli tuz çözeltisinin altı inorganik tuzu.

Bu derişimlerin yükseltilmesi önemliydi, çünkü Eagle MEM'i asgari olacak biçimde tasarlanmıştı. Kültürler onu hızla tüketiyor, sık sık besleme gerekiyordu. Amino asitlerle vitaminlerin dörde katlanması, beslemeler arasında daha yüksek hücre yoğunluklarını taşıyabilen bir besiyeri verdi; günlerce plak sayan bir virologun gereksinimi de tam olarak buydu.

Günümüzün ticari DMEM'i her bileşende birebir 4x MEM değildir. Üreticiler glisin, serin ve demir(III) nitrat ekledi ve tuz dengesini kaydırdı: sodyum bikarbonat 2.200'den 3.700 mg/L'ye çıktı, sodyum klorür ise ozmotik dengeyi korumak için 6.800'den 6.400 mg/L'ye indi. Bugün "DMEM" adıyla satılan besiyeri kararlı ve iyi tanımlanmış bir standarttır; ne var ki 1959 tarifinin birebir kendisi değil, ticari bir standarttır.

Hücre kültüründe en çok kullanılan iki bazal besiyeri bunlardır ve hangisinin seçileceği sorusu sürekli gündeme gelir. Birbirinin yerine geçmezler; aradaki farklar da görünüşte değil, yapısaldır.

Karar genellikle üç soruya iner.

Kültür yapışkan mı, süspansiyonda mı? DMEM'in 1,8 mM kalsiyumu sıkı tutunmayı destekler; RPMI'nin 0,42 mM'lik kalsiyumu ise lenfoblastoid hücreler süspansiyonda kalsın diye bilinçli olarak düşük tutulmuştur. Yapışkan fibroblast ve epitel hatları DMEM'e, süspansiyondaki lenfoid ve kan yapıcı hücreler RPMI'ye gider.

Hattın referans protokolü ne diyor? Yerleşik hatlarda bu bir tercih meselesi değildir. Bir hattı DMEM ile RPMI arasında değiştirmek ikilenme süresini, doygunluk yoğunluğunu ve çoğu zaman protein anlatımını değiştirir; hattı sonradan yeniden tanımlamadıkça yayımlanmış literatürle karşılaştırma geçersizleşir.

Kültür metabolik olarak ne kadar zorlayıcı? 25 mM glukozu ve RPMI'nin kabaca dört katı amino asit derişimiyle DMEM, yoğun, hızlı ve talebi yüksek kültürler için kurulmuştur. RPMI ise günler boyunca orta hızda büyüyen hücreler için tasarlanmıştır ve yoğun kültürler onu daha çabuk tüketir.

Hiçbiri ötekinden düpedüz daha zengin değildir. DMEM amino asit ve glukozda öndedir; RPMI ise vitaminlerde, fosfat tamponlamasında ve alışılmadık indirgenmiş glutatyon içeriğinde.

Aşağıdaki tablo standart yüksek glukozlu DMEM formülasyonudur (başlıca üreticilerde ortak olan referans formülasyon; Gibco 11965 ile Sigma D5796 sınıfı ürünlere karşılık gelir). Düşük glukozlu DMEM, D-glukozun 4.500 mg/L yerine 1.000 mg/L olması dışında birebir aynıdır.

İnorganik tuzlar ve ana bileşenler

Amino asitler (mg/L)

Glisin 30; L-arjinin·HCl 84; L-sistin·2HCl 63; L-histidin·HCl·H2O 42; L-izolösin 105; L-lösin 105; L-lizin·HCl 146; L-metiyonin 30; L-fenilalanin 66; L-serin 42; L-treonin 95; L-triptofan 16; L-tirozin disodyum tuzu dihidrat 104; L-valin 94.

Vitaminler (mg/L)

Kolin klorür 4; D-kalsiyum pantotenat 4; folik asit 4; niasinamid 4; piridoksin·HCl 4; tiamin·HCl 4; i-inositol 7,2; riboflavin 0,4.

Nelerin bulunmadığına dikkat edin. DMEM, glisin ve serin dışında esansiyel olmayan amino asit içermez — alanin, asparajin, aspartat, glutamat ya da prolin yoktur. Nükleozit, biyotin, B12 vitamini ve lipoik asit de içermez. Tek eser metali, sembolik miktardaki demir(III) nitrattır. Hücrenin gereksinim duyduğu geri kalan her şeyin serumdan gelmesi beklenir. DMEM'le ilgili en önemli yapısal gerçek budur: lipitleri, eser elementleri, taşıyıcı proteinleri ve büyüme faktörlerini serumun sağlayacağı varsayımı üzerine kurulmuş, amino asit ve vitamin bakımından zengin bir temeldir.

İki glukoz düzeyi birbirinin yerine geçen varsayılanlar değildir; alışkanlıkla birini seçmek yinelenemez verinin sık rastlanan bir kaynağıdır.

Yüksek glukoz (4.500 mg/L, 25 mM), fizyolojik kan glukozunun kabaca beş katıdır. Hızlı büyüyen transforme hatlarda, HEK293'te geçici transfeksiyon ve virüs üretiminde, hibridomalarda ve sık besleme yapmadan yüksek yoğunluğa taşımak istediğiniz her kültürde kullanın. Fazladan glukoz bir besin deposu işlevi görür. Bedeli şudur: 25 mM glukozda büyüyen hücreler ağırlıklı olarak glikolize yaslanır, laktat birikimiyle besiyerini daha hızlı asitlendirir ve incelediğiniz biyolojinin değil, besiyerinin ürünü olan glikolitik bir fenotip gösterebilir.

Düşük glukoz (1.000 mg/L, 5,6 mM), normal insan kan glukozuna yakındır. Primer hepatositlerde, yüksek glukozun farklılaşma üzerindeki etkileri belgelenmiş olan mezenkimal stromal hücrelerde, uzun süreli ya da farklılaşma kültürlerinde ve glikolizin sonuna kadar çalışmasını istemediğiniz metabolik çalışmalarda kullanın. Düşük glukozlu DMEM, oksidatif ve glikolitik metabolizmayı karşılaştırdığınızda da daha uygun seçimdir, çünkü 25 mM glukoz birçok transforme hatta Crabtree etkisi üzerinden oksidatif fosforilasyonu baskılar.

Glukozsuz DMEM de aynı nedenle vardır: karbon kaynağını kendiniz belirlemenizi sağlar — oksidatif metabolizmayı zorlamak için galaktoz koyabilir (mitokondriyal toksisite taramasında standart bir yaklaşımdır) ya da glukozu tanımlı bir düzeye ayarlayabilirsiniz.

Yerleşik bir kültürü bir glukoz düzeyinden ötekine geçiriyorsanız bunu kademeli yapın ve büyüme eğrinizi yeniden kurun. İkilenme süresi, pasajdaki doluluk ve transfeksiyon verimi birlikte değişir.

DMEM siparişindeki kafa karışıklığının çoğu, üreticilerin özgürce birleştirdiği dört bağımsız seçenekten kaynaklanır.

Glutamin. 4 mM L-glutamin standarttır, ama çözeltide bozunur — halkalanarak pirolidon karboksilik aside dönüşür ve amonyak açığa çıkarır; yarı ömrü 4 °C'de birkaç hafta, 37 °C'de çok daha kısadır. Glutamin içermeyen DMEM, kullanım anında taze glutamin eklemenize ya da çözeltide kararlı olan ve hücreler parçaladıkça glutamini yavaşça salan dipeptit biçimini (L-alanil-L-glutamin) kullanmanıza olanak verir. Bir haftadan uzun süre tam besiyeri değişimi yapılmadan tutulan her kültürde dipeptit daha doğru mühendislik tercihidir.

Sodyum piruvat. 1 mM düzeyinde piruvat, ek bir enerji kaynağı ve küçük bir antioksidan katkı sağlar. Düşük yoğunlukta ya da düşük serumda çalışan hücrelerde ekim verimine gerçekten yardımcı olur. Metabolik akı çalışması yapıyorsanız dışarıda bırakın; işaretsiz bir piruvat havuzu izleyici yorumunu karmaşıklaştırır.

Fenol kırmızısı. 15 mg/L düzeyinde bir pH göstergesidir, besin değil. Okumanıza karıştığında — 550–600 nm bölgesindeki floresans ve absorbans deneyleri, akış sitometrisi — çıkarın; ayrıca fenol kırmızısının zayıf östrojenik etkinliği olduğunu unutmayın; bu, MCF-7 gibi hormona yanıt veren hatlarda önem taşır.

HEPES. Genellikle 10–25 mM, inkübatör dışındaki işlemler sırasında pH'ı kararlı tutmak için eklenir. HEPES, pH 7,2–7,4 dolayında iyi tamponlar ve CO2'ye bağımlı değildir. Bedeli de gerçektir: HEPES ışık altında fototoksiktir, hidrojen peroksit üretir ve 25 mM düzeyinde bazı primer ve kök hücre kültürleri için sitotoksiktir. Varsayılan olarak değil, protokolünüz tezgâhta uzun süre çalışmayı gerektirdiğinde kullanın.

DMEM/F-12, DMEM ile Ham F-12'nin 1:1 karışımıdır ve serumu azaltmaya yönelen biri için DMEM ailesindeki en kullanışlı üründür.

Richard Ham'ın 1965'te yayımladığı Ham F-12, klonal büyüme için kimyasal olarak tanımlı bir besiyeri olarak tasarlanmıştı ve besin bakımından DMEM'in tam tersidir: amino asit derişimleri ölçülüdür, buna karşılık DMEM'de bulunmayan geniş bir bileşen takımı içerir — eser elementler (çinko, bakır, demir sülfat biçiminde demir), lipit öncülleri (linoleik asit, lipoik asit, putresin), nükleozit öncülleri (hipoksantin, timidin) ve ek vitaminler (biyotin, B12). İkisini karıştırmak, DMEM'in besin derişimleriyle F-12'nin genişliğini bir arada sunan bir temel verir.

Standart DMEM/F-12 formülasyonu 3.151 mg/L glukoz (17,5 mM), 2.438 mg/L sodyum bikarbonat (29 mM), 116,6 mg/L kalsiyum klorür, 55 mg/L sodyum piruvat (0,5 mM), 365 mg/L L-glutamin (2,5 mM) ve 8,1 mg/L fenol kırmızısı içerir; buna F-12 eser elementleri, F-12'deki derişimlerinin yarısında eklenir. Yaygın kullanılan bir HEPES varyantı ise 15 mM HEPES koyar ve bikarbonatı yaklaşık 1.200 mg/L'ye düşürür.

DMEM/F-12; serumsuz ve az serumlu formülasyonların, keratinosit ve epitel kültürünün, nöral kök hücrelerin (N-2 ya da B-27 takviyesiyle), hibridoma ve iPSC çalışmalarının standart temelidir. DMEM tabanlı bir süreçte serumu düşürmeye çalışıyorsanız, temeli DMEM/F-12'ye taşımak genellikle ilk verimli adımdır; çünkü serumun sessizce sağladığı eser elementler ve lipit öncülleri zaten besiyerinin içindedir.

DMEM'in çalışma pH'ı 7,2 ± 0,2'dir; besiyerinin standart spesifikasyonu ve memeli hücrelerinin çoğunun kültüre edildiği aralık budur. Bu değer, hedeflenen CO2 atmosferinde dengelenmiş tam besiyeri için geçerlidir; sayının bir anlam taşıdığı tek koşul da odur.

DMEM, bikarbonat/CO2 sistemiyle tamponlanır. Çözünmüş CO2 karbonik asit oluşturur; bu da bikarbonat ile bir protona ayrışır. pH'ı belirleyen şey, bikarbonat derişiminin CO2 kısmi basıncına oranıdır. Bunun sonucu şudur: besiyerindeki bikarbonat düzeyi ile inkübatördeki CO2 düzeyi birbirine bağlı bir çifttir.

Buzdolabından yeni çıkmış bir şişenin pH'ını ölçmenin size çok az şey söylemesinin nedeni de budur. CO2 atmosferi dışında besiyeri çözünmüş CO2'yi yitirir ve bazik okur — çoğu zaman 7,6 ve üzeri — inkübatörde ise bir iki saat içinde spesifikasyona döner. Anlamlı bir okuma istiyorsanız, önce bir alikotu kapağı gevşetilmiş hâlde inkübatörde dengeleyin ya da pH'ı CO2'ye hiç bağlı olmayan, HEPES ile tamponlanmış bir formülasyon kullanın.

DMEM'in 3.700 mg/L (44 mM) bikarbonatı %5 için değil, %10 CO2 için formüle edilmiştir. Besiyeriyle ilgili en çok göz ardı edilen gerçek budur. %5 CO2'de bikarbonat fazlalık yapar ve besiyeri bazik tarafta kalır; inkübatöre yeni konduğunda tipik olarak pH 7,6–7,8 olur ve gözle görülür biçimde pembeden mora döner. Çoğu laboratuvar DMEM'i yine de %5 CO2'de çalıştırır ve sorun yaşamaz, çünkü metabolize eden hücreler saatler içinde pH'ı geri çeken laktat ve CO2 üretir. Ne var ki yeni ekilmiş, düşük yoğunluklu bir flaskta böyle bir düzeltme yoktur ve ekim verimi düşer. %5 CO2'de kültür yapıyor ve besiyerini sürekli mor görüyorsanız ya %10 CO2'ye geçin ya bikarbonatı azaltılmış bir formülasyon kullanın ya da HEPES ekleyin.

Tersi sorun — besiyerinin sararması — düpedüz asitlenmedir. Fenol kırmızısı yaklaşık pH 6,8'in altında sarıdır. Aşırı büyüme, yüksek glukozun sürüklediği laktat üretimi, kaçak yapan ya da bitmiş bir CO2 kaynağı veya bakteriyel bir kontaminasyon bunu yapar. Dün ekilmiş ve mikroskopta seyrek görünen bir flaskta sarı besiyeri, metabolizmadan çok kontaminasyonu düşündürür.

Açık duran bir şişeden bikarbonat atmosfer basıncında CO2 olarak kaçtığı için, tezgâhta bekleyen besiyeri yavaşça bazikleşir. Bu normaldir ve inkübatörde geri döner; şişeyi atmak için değil, şişenin açık kalma süresini kısa tutmak için bir nedendir.

DMEM, yapışkan ve tutunmaya bağımlı hücrelerin standart temelidir: HEK293 ile türevleri, HeLa, NIH/3T3 ve diğer fibroblast hatları, COS-7, Vero, MDCK, C2C12 miyoblastları, primer fibroblastlar, düz kas hücreleri ve endotel hücreleri (genellikle ek takviyelerle) ve yapışkan CHO. Tipik serum takviyesi %10 fetal sığır serumudur; dayanıklı hatlarda %5–10 yeni doğan buzağı serumu da kullanılır.

DMEM'in yüksek kalsiyumu (1,8 mM) bir dipnot değil, gerçek bir seçim ölçütüdür. Bu düzeydeki kalsiyum, kaderin aracılı hücre–hücre yapışmasını destekler ve keratinosit farklılaşmasını tetikler; bu yüzden keratinosit ve bazı epitel protokolleri düşük kalsiyumlu bir temel ister. Buna karşılık sıkı tutunmaya gereksinim duyan hücreler, kalsiyumu yalnızca 0,4 mM dolayında olan RPMI'ye göre DMEM'de daha iyi sonuç verir.

DMEM, süspansiyon lenfoid kültürleri için kötü bir ilk seçimdir — insan lösemi ve lenfoma hatlarının çoğu, PBMC, düşük yoğunluktaki hibridomalar — bunlarda yerleşik temel RPMI 1640'tır. Serumsuz ve çok düşük yoğunlukta klonal büyüme için de doğru besiyeri değildir; bunun için Ham F-12 ile DMEM/F-12 geliştirilmiştir.

Serum. Standart oran %10 FBS'dir. Isıyla inaktivasyon (56 °C, 30 dakika) kompleman duyarlı çalışmalarda gelenekseldir, ama her durumda gerekli değildir ve bazı büyüme faktörlerini bozar; alışkanlıkla değil, bilerek karar verin.

Sık yapılan eklemeler. Serumu azaltılmış her DMEM kültürüne 1x esansiyel olmayan amino asit (100x stoktan) eklemek yararlıdır, çünkü DMEM'in kendi esansiyel olmayan amino asit içeriği glisin ile serinle sınırlıdır. Halihazırda yoksa 1 mM sodyum piruvat ekleyin. Penisilin/streptomisini yalnızca gerçekten gerektiğinde kullanın — rutin antibiyotik, düşük düzeyli kontaminasyonu maskeler ve mikoplazma risk profilini değiştirir.

Saklama. Sıvı DMEM 2–8 °C'de, ışıktan korunarak saklanır ve tipik olarak etiketindeki raf ömrü boyunca (yaygın olarak açılmamış hâlde 12–24 ay) kararlıdır. Glutamin eklendikten sonra besiyerini 2–8 °C'de yaklaşık dört haftalık kullanım ömrü olan bir ürün gibi görün. Riboflavin, folik asit, triptofan ve HEPES ışığa duyarlıdır; besiyerini laboratuvar aydınlatması altında bırakmak, hidrojen peroksit ile ekim verimini düşüren bozunma ürünleri oluşturur. Şişeleri açık rafta değil, karanlıkta saklayın.

Isıtma. Yalnızca kullanacağınız kadarını ısıtın. 500 mL'lik bir şişeyi tekrar tekrar 37 °C'ye getirmek glutamin bozunmasını ve bikarbonat kaybını hızlandırır. Çoğu iş için oda sıcaklığına getirmek yeterlidir; besiyerinin hücrelere gitmeden önce 37 °C'ye ulaşması gerekmez.

Toz DMEM, ölçek büyüdükçe ekonomik seçenektir; ancak sodyum bikarbonatsız gelir. Bikarbonat sulandırma sırasında eklenmeli (standart formülasyon için 3,7 g/L), pH filtrasyon sırasındaki yükselişi karşılamak üzere hedefin kabaca 0,1–0,2 birim altına ayarlanmalı ve çözelti 0,22 µm'den steril filtrasyonla süzülmelidir. En az 18,2 MΩ·cm özdirençli, düşük endotoksinli su kullanın.

DMEM fenol kırmızısıyla tamponlandığı ve saydam olduğu için kendi durumunu çoğu reaktiften daha iyi bildirir. Onu okumayı öğrenmek inkübatör kurtarır.

Bakteriyel kontaminasyon. Besiyeri hızla — çoğu zaman bir gecede — sararır ve gözle görülür biçimde bulanıklaşır. Mikroskopta hücreler arasında küçük, hareketli ya da ışığı kıran parçacıklar, yoğunluk arttıkça da titreşen bir tanecikli görünüm belirir. Tanı koydurucu birliktelik şudur: sarı renk, bulanıklık ve seyrek ya da yeni ekilmiş bir kültür. İçinde az sayıda hücre bulunan bir flaskı tek başına metabolizma asitlendiremez.

Maya kontaminasyonu. Bulanıklığa, gözle görülür oval tomurcuklanan parçacıklar eşlik eder; pH düşüşü genellikle bakterilerdeki kadar hızlı değildir. Çoğu zaman düzgün bir bulanıklık yerine ayrık kümeler biçiminde görünür.

Mantar ya da küf kontaminasyonu. Gözle görülür iplik benzeri yapılar, bazen çıplak gözle seçilebilen tüylü, yüzen bir koloni. pH bir süre normale yakın kalabilir; bu yüzden yalnızca renk denetimiyle küf gözden kaçabilir.

Mikoplazma. Tehlikeli olanı budur, çünkü standart ışık mikroskobunda bulanıklık yapmaz, renk değiştirmez ve görünür bir organizma bırakmaz. Kültürler normal görünürken büyüme hızı düşer, doygunluk yoğunluğu geriler ve deney sonuçları kayar. Mikoplazma besiyerine bakarak tanınamaz — PCR, ışıma temelli enzimatik bir test ya da DNA boyaması gerekir; rutin testin isteğe bağlı değil, yerleşik bir uygulama olmasının nedeni de budur.

Kontaminasyon olmayan durumlar. Tezgâhta bekledikten sonra besiyerinin morarması enfeksiyon değil, bikarbonat kaybıdır. Üç gün önce beslenmiş konflüent bir flaskta besiyerinin sararması olağan metabolizmadır. Soğuktan sıcağa geçişten sonra oluşan ince kristal çökelti ise genellikle mikrobiyal üreme değil, çözeltiden ayrılan kalsiyum fosfattır.

Riski azaltmak. Besiyerini çalışma hacimlerine bölerek saklayın; böylece tek bir kontaminasyon olayı koca bir şişeye mal olmaz. Şişeden boşaltılan besiyerini asla stok şişesine geri koymayın. Antibiyotiği bilinçli kullanın — rutin penisilin/streptomisin, düşük düzeyli bakteriyel kontaminasyonu görünmez ve müzmin bir hâle sokar, mikoplazmaya ise hiç etki etmez; yani çözdüğünü sandığınız sorunu gizleyebilir.

Metabolik çalışmalarda varsayılan olarak yüksek glukozlu DMEM kullanmak. 25 mM glukoz fizyolojik değil, farmakolojik bir derişimdir ve metabolik fenotipi değiştirir.

DMEM'i eksiksiz sanmak. Değildir. Serum ya da bunun için tasarlanmış bir takviye olmadan DMEM'de lipit, eser element, transferrin ve büyüme faktörü bulunmaz.

Bikarbonat/CO2 uyumsuzluğunu göz ardı etmek. Yukarıya bakın; bu, birçok laboratuvarda ekim veriminden sessizce götürür.

DMEM/F-12 ile DMEM'i birbirinin yerine kullanmak. Glukoz, kalsiyum, bikarbonat, ozmolalite ve eser element içeriğinde ayrışırlar. Birinden elde edilen veri ötekine taşınmaz.

Şişeye glutamin ekleyip tarihi unutmak. Glutamin bozunurken toksik olan ve biriken amonyak açığa çıkar. Şişeyi takviyeyi yaptığınız anda etiketleyin.

Serumlu besiyerini yanlış membrandan steril filtrelemek. Protein bağlanır ve tıkar; düşük protein bağlayan bir membran ve ön filtre kullanın.

Işık alan bir rafta saklamak. Riboflavin ile HEPES'in ışıkta bozunması, gerçek ve ölçülebilir bir sitotoksisite kaynağıdır.