Hücre kültüründe HEPES tamponu

HEPES, 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asittir; CAS numarası 7365-45-9, serbest asit formunun molekül ağırlığı 238,30 g/mol'dür. 1960'larda Norman Good ve arkadaşlarının tanımladığı zwitteriyonik tampon ailesine aittir. Bu tamponlar biyolojik çalışmalar için özellikle şu ölçütlere göre seçilmiştir: fizyolojik aralıkta bir pKa, suda yüksek çözünürlük, hücre zarlarından en az geçirgenlik, görünür ve yakın UV bölgesinde düşük absorbans, kimyasal kararlılık ve metal iyonlarıyla kompleks oluşturmaya az eğilim.

Bu tasarım ölçütleri, HEPES'in eski organik tamponlara tercih edilmesinin nedenidir. Plazma zarını serbestçe geçen bir tampon, besiyeri kadar sitoplazmayı da tamponlar ve hücre içi pH'ı bozar. Kalsiyum, magnezyum, çinko ya da demiri şelatlayan bir tampon ise formülasyondan eser metalleri çeker ve hücre davranışını biyolojik bir sonuç gibi görünen biçimlerde değiştirir. HEPES her iki sorundan da makul ölçüde kaçınır; memeli hücre kültüründe standart ek tampon haline gelmesinin nedeni budur.

HEPES kimyasal olarak birbirinden farklı iki formda satılır ve stok hazırlarken bu fark önemlidir. Serbest asit (MA 238,30) çözündüğünde güçlü asidik bir çözelti verir ve çalışma pH'ına ulaşmak için sodyum hidroksitle yukarı titre edilmelidir. Sodyum tuzu (HEPES-Na, MA 260,29) çözündüğünde bazik bir çözelti verir ve hidroklorik asitle aşağı titre edilir. Hücre kültürü için sunulan hazır 1 M çözeltiler zaten pH 7,0-7,6 penceresine titre edilmiş ve steril filtrelenmiştir; bu da hem titrasyon adımını hem de buna bağlı sodyum yükü belirsizliğini ortadan kaldırır.

Sık yanlış anlaşılan bir nokta: HEPES bir tampondur, besin değildir. Hücre metabolizmasına hiçbir katkısı yoktur. Bikarbonat ise hem tampondur hem de hücrelerin gerçekten ihtiyaç duyduğu karboksilasyon tepkimelerini besleyen bir metabolik substrattır. HEPES'in bikarbonat sisteminin yerine geçmek yerine onu tamamlamasının nedeni budur.

HEPES'in pKa'sı 25 °C'de yaklaşık 7,48'dir ve kabaca pH 6,8 ile 8,2 arasında etkili biçimde tamponlar. Bir tampon en iyi, kendi pKa'sının iki yanında yaklaşık birer pH birimlik aralıkta çalışır; fizyolojik kültür pH'ı olan 7,2-7,4 ise HEPES'in pKa'sının neredeyse tam üstüne oturur. Kullanılmasının bütün nedeni budur: tampon, tam olarak hücrelerin ihtiyaç duyduğu noktada en yüksek kapasitesiyle çalışmaktadır.

Pratikteki zorluk, HEPES'in pKa'sının sıcaklığa bağlı olması ve her 1 °C'lik ısınmada kabaca 0,014 pH birimi aşağı kaymasıdır. Sonuç somuttur ve insanları düzenli olarak yanıltır. Tezgâhta 22 °C'de pH 7,4'e titre edilmiş bir HEPES çözeltisi, inkübatörde 37 °C'de dengelendiğinde pH 7,2'ye daha yakın okunur. Deneyiniz çalışma sıcaklığında tanımlı bir pH'a bağlıysa, ya stoğu 37 °C'de titre edin ya da oda sıcaklığında bilinçli olarak daha yüksek bir hedefe titre edip kullanmadan önce değeri 37 °C'de doğrulayın.

Tedarikçi belgelerinde geçen pKa değerleri biraz değişkenlik gösterir (37 °C'de 7,31, 25 °C'de 7,48 ve 20 °C'de 7,55 rakamlarının hepsi dolaşımdadır), çünkü farklı sıcaklıklarda ve farklı iyonik güçlerde bildirilmişlerdir. Bunlar birbiriyle çelişmez; aynı sıcaklık eğrisinin farklı noktalardan örneklenmiş halidir. Uygulamada önemli olan kaymanın yönü ve kabaca büyüklüğüdür, üçüncü ondalık basamak değil.

İyonik güç de etkin pKa'yı biraz kaydırır. Fizyolojik iyonik güçteki tam bir besiyerinde tamponlama davranışı tablo değerine yeterince yakındır ve bunu düzeltmeye nadiren değer; ancak bu da pH'ı stokta değil son formülasyonda doğrulamak için bir başka nedendir.

Memeli hücre kültüründe çalışma aralığı 10-25 mM'dir; tek bir değer olarak en yaygın seçim 25 mM, hassas primer hücreler ve uzun kültürler için tercih edilen aralık ise 10-15 mM'dir. Yaklaşık 25 mM'nin üzerinde yarar düzleşir ve aşağıda ele alınan riskler öne çıkmaya başlar; 50 mM ve üzeri derişimler birçok hat için sitotoksiktir ve rutin kültürde kullanılmaz.

1 M stoktan seyreltmeler basittir:

HEPES'i, onu zaten içeren bir formülasyon satın almak yerine hazır tam besiyerine kendiniz eklediğinizde hesaba katmanız gereken iki şey var.

Ozmolalite yükselir. 1 M HEPES çözeltisi, eklendiği besiyerinden çok daha derişiktir ve eklenmesi toplam ozmolaliteyi yükseltir. Memeli besiyeri normalde 260-320 mOsmol/kg civarındadır; çalışma aralığının üst ucundan HEPES eklemek, zaten üst sınıra yakın olan bir formülasyonu sınırın ötesine itebilir. “HEPES içeren” olarak satılan besiyerlerinde bunu dengelemek için sodyum klorür azaltılmıştır; kendi takviye ettiğiniz besiyerinde ise azaltılmamıştır. Ozmotik olarak hassas hücrelerle çalışıyorsanız ölçün.

Sodyum yükü artar. HEPES serbest asidini pH 7,4'e titre etmek kabaca bir eşdeğer sodyum hidroksit gerektirir; dolayısıyla 25 mM'lik bir HEPES eklemesi buna denk gelen miktarda fazladan sodyum getirir. Rutin kültürde bu ihmal edilebilir. Elektrofizyolojide ya da ozmolalitenin titizlikle denetlendiği çalışmalarda değildir.

HEPES eklerken formülasyondan sodyum bikarbonatı çıkarmayın. Standart yapılandırma, inkübatörünüze uyarlanmış derişimdeki bikarbonatın üzerine HEPES eklenmesidir ve ikisi de işe yarar bir iş yapmaktadır.

Neredeyse bütün klasik besiyerlerinde varsayılan tampon, inkübatör atmosferindeki CO2 ile birlikte çalışan sodyum bikarbonattır. Çözünmüş CO2 hidratlanarak karbonik asidi oluşturur; o da bikarbonat ile bir protona ayrışır. Besiyerinin oturduğu pH, besiyerindeki bikarbonat derişiminin çözünmüş CO2 derişimine oranı ile belirlenir; bir formülasyonun bikarbonat içeriğinin inkübatör gaz ayarına uyarlanması gerekmesinin nedeni budur. 3,7 g/L sodyum bikarbonat içeren DMEM %10 CO2'li bir atmosfer için tasarlanmıştır; 1,5-2,2 g/L içeren formülasyonlar ise %5 CO2 içindir. 3,7 g/L'lik bir formülasyonu %5 CO2'de çalıştırmak besiyerini sürekli alkali bırakır.

Bikarbonat sisteminin zayıflığı, yarısının gaz olmasıdır. Flaskı inkübatörden çıkarın; CO2 besiyerinden, yaklaşık %0,04 CO2 içeren oda havasına kaçar. Bikarbonat geride kalır, oran değişir ve pH tırmanır. Laminer akış kabini altında yalnızca bikarbonatla tamponlanmış bir besiyeri on ila yirmi dakika içinde gözle görülür biçimde alkali tarafa kayabilir; fenol kırmızısı varsa besiyerinin kırmızıdan mora doğru dönüşünü izleyebilirsiniz.

HEPES'in uçucu bir bileşeni yoktur. Tamponlama kapasitesi eklediğiniz miktarla sabitlenmiştir ve atmosferin ne yaptığını umursamaz. Onu değerli kılan tek özellik budur ve HEPES kullanmaya değen her durumu bu açıklar.

Bunun bedeli, HEPES'in hücrelerin karboksilasyon tepkimelerinde tükettiği bikarbonat iyonunu sağlamaması ve fizyolojik tampon kimyasını yeniden üretmemesidir. Bikarbonatı tümüyle çıkarıp yerine HEPES koymak birçok hatta üremeyi yavaşlatır ya da durdurur. Neredeyse tüm durumlarda doğru yapılandırma, ikisinin birlikte kullanılmasıdır.

HEPES, hücreler kontrollü bir CO2 atmosferi dışında kayda değer zaman geçirecekse yerini hak eder:

• Gaz denetimi olmayan bir tabla üzerinde canlı hücre görüntüleme. Ortam havasında bir saat ya da daha uzun süren bir zaman serisi çekimi klasik durumdur. 20-25 mM HEPES pH'ı bu süre boyunca tutar.
• Akış sitometrisi ve hücre ayırma. Ayırma işlemleri uzun sürer, örnekler ortam CO2'sinde tüplerde bekler ve pH kayması çalışma bitmeden canlılığı düşürür.
• Primer doku ayrıştırma. Sindirimler tezgâhta, havada ve çoğu zaman 30 dakikadan birkaç saate kadar sürer. HEPES ile tamponlanmış ayrıştırma ve bekletme besiyerleri tam olarak bunun için vardır.
• Canlı kültürlerin taşınması. Binalar arasında taşınan ya da gece kargoyla gönderilen flaskların CO2 kaynağı yoktur. HEPES ile birlikte (gazlanmış değil) doldurulmuş bir flask standart yaklaşımdır.
• Sık ya da uzun süren işlemler. Kabin altında çok sayıda elleçleme adımı içeren protokollerde alkali kayma birikir; HEPES bunu düzleştirir.
• Nöron ve kesit çalışmaları. Uzun süren elektrofizyoloji ve nöron bekletme besiyerleri tam da bu nedenle rutin olarak HEPES kullanır.

Buna karşılık, bir kültür %5 CO2'li inkübatöre giriyor, haftada iki kez besleniyor ve bunun dışında rahat bırakılıyorsa, HEPES çok az yarar karşılığında maliyet ve fotokimyasal bir tehlike ekler. Rutin bir katkı maddesi değildir; belirli bir sorunun çözümüdür.

Işık sorunu gerçektir ve en sık gözden kaçırılanıdır. Zigler ve arkadaşları 1985'te, RPMI 1640'a HEPES eklenmesinin, besiyeri görünür ışığa maruz kaldığında sitotoksik ürün oluşumunu belirgin biçimde artırdığını göstermiş ve başlıca sitotoksik etken olarak hidrojen peroksiti tanımlamıştır. Tepkime için yalnızca HEPES, riboflavin ve ışık yeterlidir; besiyerinin diğer bileşenleri gerekli değildir. Deneylerinde, kültür besiyerinin yarısını hücreler eklenmeden önce üç saat ışığa maruz bırakmak timidin alımını tamamen durdurmuştur.

Bundan çıkan pratik kurallar basittir: HEPES stoklarını ve HEPES içeren besiyerlerini karanlıkta saklayın; şişeleri uzun süre tezgâh ışığı altında ve gerekenden fazla aydınlatılmış mikroskop tablalarında bırakmayın; ışık altında bekletilmiş, HEPES ile takviye edilmiş bir besiyerinde açıklanamayan toksisiteden şüphelenin. Neredeyse her tedarikçi HEPES'i bu nedenle “ışıktan koruyun” saklama talimatıyla gönderir.

Derişime bağlı sitotoksisite. 10-25 mM çalışma aralığının üzerinde HEPES'in kendisi birçok hücre tipi için sorun haline gelir. Bütün hatlar için geçerli tek bir eşik yoktur; 25 mM'nin üzerine çıkıyorsanız varsaymak yerine kendi sisteminizde bir canlılık ölçümüne karşı titre edin.

Test girişimi. HEPES her bağlamda kimyasal olarak inert değildir. Radikal kimyasına katılır, bazı metal oksitlere karşı indirgeyici davranabilir ve sülfonat grubu bazı protein ve metal bağlama testlerine karışabilir. Tampona duyarlı bir test beklenmedik bir sonuç verdiğinde, tampon meşru bir şüphelidir.

HEPES bir sterilite ya da stabilite ikamesi değildir. Glutamin bozunmasını yavaşlatmaz, mikrobiyal üremeyi engellemez ve bir besiyerinin kullanım süresini uzatmaz.

Serbest asitten 1 L'lik 1 M HEPES yapmak için 238,30 g'ı yaklaşık 800 mL hücre kültürü kalitesinde suda çözün, sodyum hidroksitle (seyrelmeyi sınırlamak için tipik olarak 5 M veya 10 M) hedef pH'a titre edin, hacmi 1 L'ye tamamlayın, ardından 0,22 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin. Hücre kültürü stoklarında steril filtrasyon otoklavlamaya tercih edilir; ısıl işlem HEPES çözeltilerinin rengini bozabilir ve bu riski karşılayacak bir yarar yoktur.

Sonucun kalitesini etkileyen noktalar:

1. Kalitesi bilinen su kullanın. HEPES stoğu doğrudan, hücrelerin içinde yaşayacağı besiyerine eklenir; dolayısıyla su olduğu gibi geçer. Doğru girdi, endotoksin düzeyi belirtilmiş, hücre kültürü kalitesinde damıtılmış sudur; endotoksin içeriği bilinmeyen laboratuvar deiyonize suyu değildir.
2. Kullanacağınız sıcaklıkta titre edin. Yukarıdaki pKa bölümüne bakın. Oda sıcaklığındaki okuma, inkübatör değeri değildir.
3. Filtreleyin, otoklavlamayın. 0,22 mikron ve tarih etiketi.
4. Soğukta ve karanlıkta saklayın. Sıvı stok için olağan koşul, ışıktan korunmuş 2-8 °C'dir. Toz form daha bağışlayıcıdır ve normalde ışıktan korunarak ortam sıcaklığında saklanır.
5. Endotoksine dikkat edin. Tamponlar, bir kültüre endotoksin girmesinin sık görülen ve az denetlenen yollarındandır. Çalışmanız endotoksine duyarlıysa (primer bağışıklık hücreleri, kök hücreler, düzenlemeye tabi bir uygulamaya giden her şey), spesifikasyonu belirtilmemiş reaktiflerden hazırlanmış bir stok yerine, endotoksin spesifikasyonu bildirilmiş bir stok kullanın.

Tozdan büyük hacimlerde besiyeri hazırlayan laboratuvarlar için HEPES'i dökme toz olarak alıp kendi bünyesinde titre etmek, steril 1 M çözelti almaya kıyasla mol başına belirgin biçimde ucuzdur. Tam besiyeri şişelerini az sayıda takviye eden laboratuvarlar için ise steril 1 M çözelti pragmatik seçimdir: tartım yok, titrasyon yok, filtrasyon adımı yok ve ev yapımı bir stokla bir parti besiyerini kontamine etme olasılığı yok.