Hücre Kültüründe Penisilin-Streptomisin ve Antibiyotik-Antimikotik

Pen-Strep, normalde karşılaşacağınız tek biçim olan 100X'lik derişik çözelti olarak satılır. Standart bileşim üreticiden üreticiye değişmez:

Penisilin-Streptomisin, 100X

Antibiyotik-Antimikotik, 100X

Her ikisi de tipik olarak %0,85-0,9'luk tuz çözeltisi içinde hazırlanır ve steril filtrasyondan geçirilir. Kullanmak için besiyerinin her litresine 10 mL 100X çözelti, ya da 500 mL'lik şişe başına 5 mL ekleyin.

Penisilinin kütle olarak değil birim olarak verildiğine dikkat edin; bu, penisilin preparatlarının saflığının değişken olduğu dönemlerden kalma tarihsel bir gelenektir. Penisilin G sodyum için 1 birim yaklaşık 0,6 µg'a karşılık gelir, yani 100 U/mL kabaca 60 µg/mL demektir. Streptomisin ise kütle üzerinden verilir. Birini diğerine çevirmeye kalkışmayın ve iki bileşenin eşit etkinlikte bulunduğunu varsaymayın.

Daha düşük bir seçenek. ATCC, antibiyotik hiç kullanılacaksa nihai derişimin 50-100 IU/mL penisilin ve 50-100 µg/mL streptomisin olmasını önerir. Bu aralığın alt ucunda çalışmak — pratikte 0,5X — antibakteriyel etkinin büyük bölümünü korurken metabolik ve hedef dışı yükü azaltır; hassas hücrelerde değerlendirmeye değer.

Penisilin G, Penicillium küflerinin ürettiği bir beta-laktamdır. Penisilin bağlayan proteinlere bağlanır ve peptidoglikan sentezinin transpeptidaz katalizli çapraz bağlanma basamağını durdurur; böylece bakteriler işlevsel bir hücre duvarını tamamlayamaz ve bölünmeye çalışırken parçalanır. Hücre duvarı yapımı üzerinden etki ettiği için yalnızca etkin biçimde çoğalan organizmalara karşı bakterisidaldir. Hücre kültürü bağlamındaki etki spektrumu ağırlıklı olarak Gram-pozitiftir.

Streptomisin, Streptomyces griseus'tan elde edilen bir aminoglikozittir. 30S ribozomal alt birime bağlanır, mRNA'nın yanlış okunmasına yol açar ve translasyonun başlamasını engeller; bu da bakterisidal etkidir. Kapsamı ağırlıklı olarak Gram-negatiftir, bazı Gram-pozitiflere karşı da işe yarar bir etkinliği vardır. İkisinin birleştirilmesinin nedeni tam olarak bu tamamlayıcı spektrumlardır: aralarında, kültür şişesine deriden, havadan ve sudan en sık ulaşan bakteriyel kontaminantları örterler.

Antimikotik bileşen olan amfoterisin B, Streptomyces nodosus'tan elde edilen bir polien makrolittir ve çoğu zaman Fungizone ticari adıyla listelenir. Mantar zarlarındaki ergosterole bağlanır ve iyonlarla küçük molekülleri sızdıran gözenekler oluşturarak mayaları ve küfleri öldürür.

Amfoterisin B'nin kendine özgü bir uyarısı vardır. Seçiciliği, kolesterol yerine ergosterolü yeğlemesinden gelir; ama bu yeğleme mutlak değil, bir derece meselesidir. Yaklaşık 2,5 µg/mL'nin üzerindeki derişimlerde memeli hücreleri için ölçülebilir biçimde toksik hâle gelir; çalışma derişiminin 0,25 µg/mL'de tutulmasının nedeni budur — çoğu kişinin sandığından dar olan, on katlık bir güvenlik payı. Ayrıca kararsızdır, ışığa duyarlıdır ve çözeltiden çökme eğilimindedir. Anti-anti eklenmiş bir kültür, aynı hücrelerin yalnızca Pen-Strep'li hâline göre daha yavaş çoğalıyorsa ilk şüphelenilecek şey amfoterisin B'dir.

Ayrı olarak sunulan gentamisin, 10-50 µg/mL'de kullanılan daha geniş spektrumlu bir aminoglikozittir. Besiyerinde penisilinden belirgin biçimde daha kararlıdır; bu yüzden primer doku çalışmalarında ve penisilin etkinliğinin söneceği uzun kültür süreçlerinde çoğu zaman yeğlenir.

Pen-Strep'in iki bileşeni aynı hızda bozunmaz ve bunun önemi, genellikle hak ettiğinden daha az kabul görür.

Penisilin G kimyasal olarak kırılgandır. Beta-laktam halkası sulu çözeltide hidrolize olur ve süreç 37 °C'de ve alkali pH'ta hızlanır. İnkübatör sıcaklığındaki tam besiyerinde penisilin, etkinliğinin önemli bir bölümünü yaklaşık üç gün içinde yitirir ve kabaca beş günde büyük ölçüde tükenir. Pazartesi beslenen bir şişenin perşembe günü anlamlı ölçüde daha az penisilin koruması vardır.

Streptomisin belirgin biçimde daha kararlıdır ve normal bir besiyeri değiştirme aralığı boyunca işe yarar etkinliğini korur.

Pratik sonuç şudur: haftada bir beslenen bir kültürde Pen-Strep, o haftanın büyük bölümünde fiilen yalnızca streptomisin artı bir miktar artık penisilindir. Kâğıt üzerinde korunan kültürlerde Gram-pozitif kontaminasyonun sızması yolundaki yaygın gözlemi kısmen bu açıklar. Belirli bir deney için antibiyotik koruması gerçekten önemliyse, bu durum daha yüksek bir Pen-Strep dozunu değil, daha sık besiyeri değişimini ya da gentamisin gibi daha kararlı bir ajanı gerektirir.

Derişik çözeltinin saklanması. 100X çözeltileri -5 ila -20 °C'de, ışıktan korunarak dondurulmuş hâlde saklayın. 37 °C'de değil, 2-8 °C'de ya da oda sıcaklığında çözün, yavaşça karıştırın ve tekrarlanan donma-çözünmeden kaçının. Büyük bir şişeyi ilk çözmede tek kullanımlık hacimlere bölün. Besiyerine seyreltildikten sonra, o besiyerini yukarıda anlatıldığı gibi sınırlı bir antibiyotik ömrüne sahip sayın.

Bu çözeltileri otoklavlamayın ve ısıtmayın; derişik çözeltiyi, kullanımdan önce uzun süre 37 °C'de ısıtılmakta olan bir besiyerine eklemeyin.

Pen-Strep'i arayan çoğu kişinin aslında sorduğu soru budur ve bir ürün tanıtımı yerine doğrudan bir yanıtı hak eder.

Hücre bankalarının ve deneyimli kültür laboratuvarlarının ortak görüşü, sağlıklı ve yerleşik kültürlerde sürekli, rutin antibiyotik kullanımının iyi bir uygulama olmadığıdır. ATCC açıkça, rutin hücre kültüründe antibiyotik ya da antimikotik kullanmadığını ve özellikle gerekmedikçe rutin kullanımı önermediğini belirtir — örneğin transfekte bir hattı baskı altında tutan G418 gibi bir seçici ajan böyle bir gerekliliktir. Bu duruş bir titizlik takıntısı değildir; birkaç somut soruna dayanır.

Antibiyotikler kontaminasyonu önlemez, maskeler. Temel argüman budur. Pen-Strep bir kültürü sterilize etmez; bakteri üremesini fark edemeyeceğiniz düzeyin altına bastırır. İki günde besiyerini bulandırıp hemen yakalanacak olan düşük düzeyli bir kontaminant, bunun yerine aylarca sessizce sürebilir; pH'ı değiştirir, besinleri tüketir, endotoksin salar ve hücrelerinizin davranışını kaydırır — üstelik şişe normal görünürken. Kontaminasyon böylece geç, yani diğer kültürlere yayıldıktan ve sonuçlarınızı sessizce etkiledikten sonra keşfedilir.

Mikoplazmaya hiçbir etkileri yoktur. Mikoplazmanın hücre duvarı yoktur, dolayısıyla penisilinin hedefi de yoktur. 100 µg/mL'deki streptomisin de güvenilir biçimde etkili değildir. Mikoplazma, açık ara en ciddi sonuçları olan kültür kontaminantıdır — görünmezdir, dolaşımdaki kültürlerin kayda değer bir bölümünde bulunur ve metabolizmayı, çoğalma hızını ve gen ifadesini değiştirir. Pen-Strep ona karşı hiçbir koruma sağlamaz; üstelik şüpheli bir şişeyi atmanıza yol açacak görünür bakteriyel kontaminasyonu bastırarak mikoplazma pozitif bir kültürün ömrünü uzatabilir.

Hücreleriniz açısından biyolojik olarak etkisiz değildirler. Yayımlanmış çalışmalar, standart kültür derişimlerindeki antibiyotiklerin memeli hücrelerinde gen ifadesini değiştirdiğini ve işlevsel okumaları etkileyebildiğini göstermiştir — bir çalışma, antibiyotiklerin süspansiyon kültüründe küre oluşturma yeteneğini baskıladığını bulmuştur. Özellikle amfoterisin B'nin antifungal ve sitotoksik derişimleri arasındaki pay dardır. Deneyiniz ince bir şeyi ölçüyorsa, antibiyotikler onun içinde denetlenmeyen bir değişkendir.

Direnç seçerler. Sıcak ve besince zengin bir ortamda sürekli, öldürücü altı maruziyet, dirençli organizmaların seçilmesi için neredeyse ideal koşuldur. Antibiyotiği sürekli kullanan laboratuvarlar zamanla, antibiyotiklerin artık dokunamadığı kontaminantlar edinme eğilimindedir.

Tekniğin yerine geçerler. En zararlı etki biyolojik değil kültüreldir. Antibiyotiğe güvenen bir laboratuvar kendi aseptik hatalarını görmeyi bırakır, çünkü geri bildirim sinyali — özensiz bir kabin seansının ertesi günü bulanan bir şişe — ortadan kaldırılmıştır.

Antibiyotiklerin gerçekten haklı olduğu yerler:

• Primer doku izolasyonu, başlangıç materyalinin steril olmadığı ve dokunun kolayca yenilenemediği durumlar.
• Hücre ayırma ve akım sitometrisi, cihaz akışkan hatlarının steril bir ortam olmadığı yerler.
• Yeri doldurulamaz materyal — benzersiz bir hasta örneği ya da zor bir primer hat — kültürü yitirmenin sakıncalardan daha kötü olduğu durumlar; genelde süresiz değil, sınırlı bir dönem için.
• Değerli bir stoğun kısa süreli kurtarılması, ardından antibiyotiksiz temiz bir çalışma bankasının çoğaltılması.
• Büyük ölçekli biyoproses işletmeleri, tanımlı bir risk değerlendirmesinin dengeyi kullanım lehine bulduğu durumlar.

Birçok laboratuvarın uyguladığı işe yarar bir orta yol: ana ve çalışma stoklarını antibiyotiksiz tutmak — böylece herhangi bir kontaminasyon kendini hemen belli eder — ve antibiyotiği yalnızca risk profilinin bunu haklı çıkardığı belirli deneylere eklemek. Şu an her şeyde Pen-Strep kullanıyorsanız, yararlı deney şudur: uslu bir hattı birkaç pasaj boyunca antibiyotiksiz taşıyın ve gerçekten bir şey olup olmadığını görün. Tekniği sağlam bir laboratuvarda genellikle hiçbir şey olmaz.

Görünür bir kontaminasyona verilecek doğru yanıt nadiren antibiyotik eklemek ya da artırmaktır.

Yenilenebilir bir kültürdeki bakteriyel ya da fungal kontaminasyon: atın. Şişeyi otoklavlayın veya başka biçimde dekontamine edin, aynı anda açık olan besiyeri şişesini ve reaktif alikotlarını atın, inkübatörü ve kabini dekontamine edin ve dondurulmuş bir viyalden yeniden başlayın. Gözle görülür biçimde kontamine bir kültürü tedavi etmeye çalışmak genellikle bastırılmış ama kalıcı bir kontaminant üretir ve onu inkübatörün geneline yayma riski taşır.

Belirtiyi tedavi etmek yerine kaynağı bulun. Yinelenen kontaminasyonun bir nedeni vardır: bir su banyosu, bir inkübatör su tepsisi, çatlamış bir kabin filtresi, temiz olmayan bir pipetör, ortak kullanılan bir besiyeri şişesi ya da belirli bir teknik hatası. Antibiyotikler, onu bulmak için gereken kanıtı gizler.

Mikoplazmayı bağımsız ve düzenli olarak test edin. PCR temelli ve lüminesans temelli mikoplazma testleri ucuz ve hızlıdır. Yeni hatları geldiklerinde test edin, bankalamadan önce test edin ve sonrasında düzenli aralıklarla yineleyin. Rutin kullanımdaki hiçbir antibiyotik testin yerini tutmaz. Mikoplazmaya özel reaktifler vardır ve enfekte bir kültürü temizleyebilirler; ama bunlar yeri doldurulamaz materyal için bir kurtarma aracıdır, bir bakım stratejisi değil — temizlenen kültürler yeniden test edilmeli ve yeniden bankalanmalıdır.

Gelen kültürleri karantinaya alın. Bir laboratuvara mikoplazmanın girmesinin açık ara en yaygın yolu, bir iş ortağından gelen hücrelerdir. Test edilene kadar ayrı işleyin.

Reaktifleri denetleyin. Serum, tripsin ve besiyeri olası kaynaklardır. Saygın tedarikçiler biyoyük ve mikoplazma testi yapar; analiz sertifikaları da okunmadan dosyalanmak yerine gözden geçirilmelidir.

Besiyerine ekleme. 100X derişik çözeltiyi, besiyeri hazırlandıktan ve gerekiyorsa filtrelendikten sonra litre başına 10 mL olacak biçimde ekleyin. Yavaşça ters çevirerek karıştırın. Yeniden filtrelemeye gerek yoktur — derişik çözelti steril filtrasyondan geçirilmiş olarak sunulur.

Bozunmayı fazla doz vererek telafi etmeye çalışmayın. Pen-Strep derişimini ikiye katlamak korumayı ikiye katlamaz, buna karşılık hücrelerinizdeki hedef dışı etkileri artırır. Sorun korumanın süresiyse, besiyerini daha sık değiştirin ya da daha kararlı bir ajan kullanın.

Serumsuz ve kimyasal olarak tanımlı besiyerleri. Serumsuz besiyerindeki hücreler, aynı hücrelerin %10 serumdaki hâline göre genellikle kimyasal strese daha duyarlıdır; çünkü serum proteinleri birçok bileşiği tamponlar ve bağlar. Serumsuz bir süreçte antibiyotik kullanıyorsanız, geçişten sonra çoğalma hızını ve canlılığı dikkatle izleyin ve derişim aralığının alt ucunu değerlendirin.

Seçici antibiyotikler ayrı bir konudur. Puromisin, G418, higromisin, blastisidin ve zeosin, kontaminasyonu önlemek için değil, mühendislik ürünü hücreler üzerinde seçici baskıyı sürdürmek için kullanılır. Rutin antibakteriyel kullanıma karşı argümanlar onlar için geçerli değildir; ancak transgeninizin hâlâ ifade edildiğini doğrulama gerekliliği geçerlidir.

Kayıt tutma. Belirli bir deneyin antibiyotikli mi antibiyotiksiz mi yürütüldüğünü kaydedin. Bu bir değişkendir, bazı okumaları gerçekten etkiler ve laboratuvarlar arasında sonuçlar tutmadığında geriye dönük bakabilmek değerlidir.