Hücre Kültürü Besiyerinde Fenol Kırmızısı

Fenol kırmızısı, kimyasal adıyla fenolsülfonftalein, serbest asit hâlinde 354.4, besiyeri formülasyonlarında kullanılan sodyum tuzu hâlinde 376.4 molekül ağırlığına sahip bir sülfonftalein boyadır. Klasik hücre kültürü besiyerlerinin çoğuna tek bir nedenle katılır: geçiş aralığı, memeli hücrelerinin kültüre edildiği pH değerini tam olarak kapsayan bir pH indikatörüdür.

Ne olmadığını da açıkça söylemek gerekir. Fenol kırmızısı bir tampon değildir. Besiyerlerindeki 5-15 mg/L düzeyinde kabaca 13-40 mikromolar bulunur; buna karşılık sodyum bikarbonat 24-44 milimolardır — üç büyüklük mertebesi daha az. Besiyerinin pH kararlılığına ölçülebilir hiçbir katkısı yoktur. O bir gösterge değeridir, bir denetim aracı değil.

Ayrıca bir besin ya da bir takviye değildir ve hücrelerin ona ihtiyacı yoktur. Her klasik besiyerinin fenol kırmızısı içermeyen bir sürümü vardır ve hücreler bu sürümlerde tıpkı renkli olanlardaki gibi ürer. Boya yalnızca şunun için vardır: inkübatörün önünden geçen bir araştırmacı, hiçbir şeyi açmadan, bir saniyede kültürün yanlış yöne gidip gitmediğini görebilsin.

Derişim formülasyonlar arasında standart değildir; aynı turuncu tonunun farklı besiyerlerinde biraz farklı anlamlar taşımasının ve RPMI'nin renginin hiçbir zaman DMEM'in rengine tam benzememesinin nedeni budur.

Ham's F-12, 1.2 mg/L ile aykırı değerdir; F-12'nin DMEM'e kıyasla soluk ve donuk görünmesinin, 1:1 karışım olan DMEM/F-12'nin ise 8.1 mg/L ile ikisinin arasında durmasının nedeni budur. Flasklar arasında renk karşılaştırıyorsanız yalnızca aynı besiyerini içeren flaskları karşılaştırın.

Bazı dengeli tuz çözeltileri fenol kırmızısı taşır, bazıları taşımaz. HBSS her iki biçimde de satılır; PBS ve DPBS genellikle fenol kırmızısı içermeden sunulur.

Fenol kırmızısı pH 6.8 ile 8.2 arasında sarıdan kırmızıya doğru kademeli bir geçiş gösterir; pKa değeri yaklaşık 7.7 ile 8.0 arasında bildirilmiştir. Asit biçimi en çok 443 nm dolayında, baz biçimi ise 570 nm dolayında absorbans verir; boyanın birbirinden çok farklı iki görünümünün nedeni budur.

Edinilmesi gereken alışkanlık, rengi bir referansa karşı karşılaştırmaktır. Flaskı beyaz bir zemine karşı, aynı sıcaklıktaki aynı taze besiyerinin şişesinin yanında tutun. Tek başına, iki farklı besiyeri arasında ya da renkli bir tezgâha karşı yapılan renk değerlendirmesi güvenilir değildir. Aşağıdaki karşılaştırma tablosu uygulamadaki yorumu verir.

Herhangi bir renge göre işlem yapmadan önce bir uyarı: renk yarı nicelikseldir ve gecikmelidir. Bir kültür, besiyeri gözle görülür biçimde kaymadan önce metabolik olarak zorlanmış olabilir; sonunda gördüğünüz kayma da hücrelerin şu anki durumunu değil, saatler boyunca biriken asit yükünü yansıtır. Rengi tek başına bir tanı olarak değil, mikroskoba bakmak için bir uyarı olarak görün.

Sarı asit demektir ve hücre kültüründe asit neredeyse her zaman laktat demektir. Kültürdeki hücreler yüksek hızda aerobik glikoliz yapar ve besiyerine laktat verir; ona eşlik eden protonlar bikarbonat tamponunu aşağı titre eder ve pH yaklaşık 6.8'in altına düştüğünde indikatör tümüyle sarı biçimine geçer.

Sık görülen nedenler, kabaca sıklık sırasıyla:

Kültür yalnızca yoğundur. Konflüent ya da aşırı konflüent bir tek tabaka veya en yüksek yoğunluğuna yaklaşan bir süspansiyon kültürü, bir gün içinde besiyerini sarartacak kadar laktat üretir. Bu normal biyolojidir ve çözüm beslemek ya da pasajlamaktır. Bir flask her seferinde planlanan beslemeden önce sararıyorsa daha az hücre ekin veya daha sık besleyin.

Kültür fazla uzun bırakılmıştır. Hafta sonu boyunca besiyerinin tükenmesi klasik örnektir. Glikoz düşer, laktat birikir ve kültür asit içinde o kadar uzun kalır ki taze besiyeri eklendikten sonra bile canlılık düşer.

Bakteriyel kontaminasyon. Bakteriler besiyerini memeli hücrelerinden çok daha hızlı asitlendirir ve genellikle aynı anda bulanıklaştırır. Belirtisi, dün iyi olan besiyerinin bugün parlak sarı ve bulanık olmasıdır; çoğu zaman yüksek büyütmede görünen hareketli parçacıklar da eşlik eder. Kurtarmaya çalışmayın, atın ve aynı seansta elden geçen her şeyi kontrol edin.

Fazla CO2 ya da inkübatöre uymayan besiyeri. %5 CO2 için formüle edilmiş bir besiyeri %10'da çalıştırılırsa baştan asit tarafta durur. Bikarbonatı atmosfere göre eşleştirin: yaklaşık 1.5 g/L sodyum bikarbonatın altındaki besiyerleri ortam havasına ya da %4 CO2'ye, 1.5-2.2 g/L olanlar %5'e, 3.5 g/L'nin üzerindekiler %10'a uyar. DMEM 3.7 g/L ile %10 CO2 için formüle edilmiştir ve %5'lik bir inkübatörde tasarım noktasına göre bir miktar asit tarafta çalışır — çoğu laboratuvar bunu sorunsuz kabul eder, ama bir flask ilk günden turuncu göründüğünde bunu bilmekte yarar vardır.

Pembe ya da fuşya alkali demektir ve bikarbonatla tamponlanmış bir besiyerinde alkalilik neredeyse her zaman CO2'nin sistemden ayrıldığı anlamına gelir. Bikarbonat hâlâ oradadır; onu dengeleyen karbonik asit gaz olarak kaçmıştır ve pH yükselir.

Besiyeri inkübatörden çıkarılmıştır. Bu, açık ara en yaygın yanlış alarmdır. Tezgâha taşınan bir flask hemen CO2 kaybetmeye başlar ve dakikalar içinde gözle görülür biçimde pembeleşir. Bu, kültür hakkında hiçbir şey söylemez. Rengi doğrudan inkübatörden çıkan flasklarda değerlendirin ya da tezgâhta fotoğrafladığınız her şeyin olduğundan daha alkali görüneceğini kabul edin.

İnkübatör CO2 vermiyordur. Boş bir tüp, kapalı bir vana, bozulmuş bir regülatör ya da kayan bir sensör, inkübatördeki bütün flaskları hep birlikte pembeleştirir. Bütün kültürleriniz aynı anda pembeleştiyse hücrelerden önce inkübatörden şüphelenin — ve CO2 değerini bağımsız bir ölçerle kontrol edin, çünkü kalibrasyonu bozuk bir sensör hiç gaz vermezken ayar noktasını bildirir.

Kapak açık kalmıştır ya da inkübatör aşırı doludur. Sık ya da uzun süreli kapak açılmaları ayar noktasına dönüşü engeller. Önde duran flasklar önce pembeleşir.

Gevşek kapaklar ya da yanlış kap. Havalandırmalı kapaklar inkübatör atmosferiyle dengelenmek üzere tasarlanmıştır. CO2 inkübatöründe bikarbonatlı bir besiyeri üzerindeki sızdırmaz kapak dengelenmeyi engeller; tezgâh üstü bir kültürdeki havalandırmalı kapak ise CO2'nin kaçmasına izin verir. Kapağı, kültürün yaşadığı yere göre seçin.

Bikarbonat atmosfere göre fazla yüksektir. Asit durumunun ayna görüntüsü: 2.2 g/L bikarbonatlı bir Earle tuzlu formülasyon ya da 3.7 g/L ile DMEM, ortam havasında bırakıldığında hızla alkaliye kayar. Havada pH'ı tutmak üzere tasarlanmış olanlar, 0.35 g/L ile Hanks tuzlu formülasyonlardır.

Bazı bulaşan etkenler alkaliye kaydırır. Bulaşan organizmaların bir azınlığı pH'ı düşürmek yerine yükseltir. Pembe artı bulanıklık, aksi kanıtlanana kadar yine kontaminasyondur.

Açıkça belirtmeye değecek iki hata biçimi var.

Mikoplazma genellikle ne renk değişimi ne de bulanıklık yapar. Mikoplazma bulaşmış kültürler çoğu zaman tümüyle normal görünür — berrak besiyeri, beklenen renk, üreyen hücreler — organizma bu sırada metabolizmayı, gen ifadesini ve deney sonuçlarını değiştirir. Mikoplazma taraması için renk işe yaramaz. Tek güvenilir yaklaşım, sabit bir takvime bağlı olarak PCR ya da özel bir saptama testiyle rutin test yapmaktır.

Normal bir renk, besiyerinin besin açısından sağlam olduğu anlamına gelmez. Glikoz önemli ölçüde tükenmiş, glutamin amonyağa yıkılmış olabilir ve indikatör pek kıpırdamaz. Fenol kırmızısı yalnızca proton dengesini bildirir, başka hiçbir şeyi değil. Renk olarak iyi görünen bir kültür yine de aç kalmış olabilir.

Akılda tutulmaya değer uygulamaya dönük bir sınır daha var: fenol kırmızısı, yoğun ve sağlıklı bir kültür ile kontamine bir kültürü ayırt edemez. İkisi de besiyerini sarartır. Hangisi olduğunu renk değil, mikroskop söyler.

Fenol kırmızısı optik ölçümlere karışır; onu çıkarmanın başlıca nedeni budur.

Absorbans testleri. Boya 443 nm ve 570 nm dolayında güçlü absorbans verir. Bu ikinci tepe, birkaç standart kolorimetrik testin okuma dalga boyunun tam üzerine oturur — MTT genellikle 570 nm'de, Griess nitrit testi ise yaklaşık 540 nm'de okunur — bu yüzden geride kalan fenol kırmızısı kör değerini şişirir ve dinamik aralığı daraltır. Test bir besiyeri körü içerse bile renkli bir zemin duyarlılığa mal olur; üstelik boyanın absorbansı pH'a bağlı olduğu için zemin, kuyucuğun metabolik durumuyla birlikte kayar. Plakaları sessizce bozan asıl nokta budur: yoğun bir kuyucuk ile sakin bir kuyucuğun zeminleri farklıdır.

Floresan ölçümler. Fenol kırmızısı yeşilden turuncuya uzanan aralıkta geniş bir zemin sinyali katar ve iç filtre etkileriyle sinyali söndürebilir. Canlı hücre görüntülemesi, floresan plaka okuyucu testleri ve üzerinde hâlâ besiyeri bulunan hücrelerin akış sitometrisi, fenol kırmızısı içermeyen formülasyonlardan yarar görür. Görüntüleme için yaygın seçim, HEPES içeren ve fenol kırmızısı içermeyen bir besiyeridir; çünkü bu, CO2 atmosferi dışındaki mikroskop tablasında pH'ı da tutar.

Östrojene yanıt veren hücrelerle çalışma. Bir sonraki bölümde ele alınıyor.

Biyoüretim ve saflaştırma süreçleri. Bir besiyeri bileşeninin üründen uzaklaştırılması gerektiğinde, gereksiz bir boya gereksiz bir uzaklaştırma sorunu demektir; üretim besiyerlerinde fenol kırmızısı içermeyen formülasyonlar standarttır.

Bazı kütle spektrometrisi ve metabolomik iş akışları, çünkü boya ve safsızlıkları kirletici iyonlar olarak görünür.

Bunu tam olarak söylemekte yarar var, çünkü çokça ve bozularak tekrarlanıyor.

Berthois, Katzenellenbogen ve Katzenellenbogen 1986'da, fenol kırmızısı preparatlarının 15-45 mikromolarda ölçülebilir östrojenik etki gösterdiğini bildirdi; bu, boyanın kültür besiyerlerinde bulunduğu aralığın tam kendisidir. MCF-7 insan meme kanseri hücrelerinin östrojen reseptörüne, östradiolün yaklaşık %0,001'i kadar bir afiniteyle bağlanma (Kd yaklaşık 2 x 10^-5 M) ve östrojen reseptörü pozitif MCF-7 hücrelerinde doza bağlı çoğalma uyarımı buldular; reseptör negatif MDA-MB-231 hücrelerinde ise böyle bir etki yoktu.

İki yıl sonra Bindal ve arkadaşları, HPLC ve çözücü ayrımıyla, reseptöre bağlanmanın ve büyümeyi destekleyici etkinin fenolsülfonftaleinin kendisine değil, ticari preparatlarda bulunan daha lipofilik safsızlıklara ait olduğunu gösterdi — bunlardan biri bis(4-hidroksifenil)[2-(fenoksisülfonil)fenil]metan olarak tanımlandı — ve girişim yaratacak miktarların piyasadaki birçok preparatta bulunduğunu ortaya koydu. İlgili çalışmalar katyon taşınımı üzerindeki etkileri de lipofilik bir safsızlığa bağladı.

Uygulamadaki sonuç her iki durumda da aynıdır ve hangi molekülün sorumlu olduğuna bağlı değildir: östrojen yanıtlarını ya da östrojen reseptörü sinyalinin altındaki herhangi bir şeyi çalışıyorsanız fenol kırmızısı içermeyen besiyeri kullanın. Standart bileşim, fenol kırmızısı içermeyen besiyeri ile aktif kömürle arındırılmış serumdur; bu, hem boyayla ilişkili etkiyi hem de serumun kattığı steroidleri ortadan kaldırır. Belirli bir fenol kırmızısı partisinin saflığını tezgâhta doğrulayamazsınız; bu yüzden değişkeni tümüyle ortadan kaldırmak, partinin temiz olduğunu varsaymaktan daha güvenilirdir.

Östrojen reseptörü olmayan ve bu yolla ilgilenmeyen hücreler için bu, besiyeri değiştirmek için bir gerekçe değildir.

Fenol kırmızısını bırakmak; bedava, sürekli ve tek bakışta okunan pH sinyalinden vazgeçmek demektir ve geçiş yapan laboratuvarlar çoğu zaman ona ne kadar güvendiklerini fark etmez. Kontamine flasklar daha geç fark edilir, tükenmiş besiyeri ise daha da geç.

Yerine koymaya değer üç önlem var. Besleme takvimini gözle değil, o hücre hattının o ekim yoğunluğundaki büyüme eğrisine dayanarak sabitleyin. Önemli olduğunda pH'ı doğrudan ölçün — kullanılmış besiyerinden alınan bir alikotta kalibre bir pH metre bir dakika sürer. Ve uzun süreli, fenol kırmızısı içermeyen bir deney yürütüyorsanız aynı hattan, aynı takvimde renkli bir kontrol flaskı tutun; böylece renksiz kültürlerin ne zaman ilgi istediğine dair görsel bir referansınız olur.

10-25 mM HEPES eklemek, fenol kırmızısı içermeyen çalışmalarda sık görülen bir tamamlayıcı değişikliktir; çünkü görüntüleme ya da uzun süren işlemler sırasında CO2 inkübatörü dışında pH'ı tutar. HEPES indikatörün yerini tutmaz — kararlılığı ele alır, görünürlüğü değil — ve ışık altında fototoksisite dâhil kendi dikkat noktaları vardır.

Giderilmesi gereken son bir karışıklık: fenol kırmızısı mikrobiyolojide karbonhidrat fermentasyon buyyonlarında da indikatör olarak kullanılır; bu, farklı bir bağlamda farklı bir uygulamadır. Bu sayfadaki bilgiler, fenol kırmızısının memeli hücre kültürü besiyerlerindeki pH indikatörü işlevine ilişkindir.