DF-1 Tavuk Embriyo Fibroblast Hücreleri

DF-1, resmî adıyla UMNSAH/DF-1 ve ATCC CRL-12203 koduyla depolanmış hâliyle, East Lansing Line 0 (EV-0) tavuk embriyo fibroblastlarından kurulmuştur. Bu kaynak hattın seçilmiş olması, hücre hattına dair en önemli tek olgudur.

Tavuk genomlarının çoğu endojen aviyan lökoz virüsü (ev) proviral lokusları taşır — germ hattına entegre olmuş, ifade edilebilen, viral protein ve partikül üretebilen retroviral diziler. Çoğu amaç için bunun bir önemi yoktur; ancak aviyan retrovirüs araştırmaları ve aşı üretimi açısından ciddi bir karıştırıcı etkendir: ekzojen aviyan lökoz virüsünü arayan bir test, gelen virüsü endojen olandan temiz biçimde ayırt edemez ve endojen retroviral dizileri ifade eden bir aşı substratı düzenleyici açıdan sorun yaratır. East Lansing Line 0 ev lokuslarından yoksundur, dolayısıyla DF-1 bu özelliği devralır. Kolayca ulaşılabilen, kendiliğinden ölümsüzleşmiş ve endojen virüs içermeyen tek aviyan hücre hattı olarak tanımlanır.

Ölümsüzleşme kendiliğinden oldu. Primer tavuk embriyo fibroblastları kültürde kriz ve yaşlanma (senesans) evrelerinden geçirildi ve sınırsız bölünmeyi sürdüren bir popülasyon ortaya çıktı. Hiçbir onkogen aktarılmadı, virüs kullanılmadı, kimyasal karsinojen uygulanmadı. Bu önemlidir; çünkü viral yolla dönüştürülmüş hatlar, dönüştürücü etkenin dizilerini her deneyin içine taşır.

Ölümsüzleşmenin altında ne var. Yayımlanmış karakterizasyon, ölümsüz fenotipi hücre döngüsü ve hücre ölümü düzenleyicilerinin değişmiş ifadesine — özellikle işlevsiz p53 ve E2F-1'e — ve antioksidan gen ifadesindeki değişikliklere bağlar. Bu nedenle DF-1, viral yolla dönüştürülmüş bir hat olmasa da büyüme denetimi bakımından normal diploid bir fibroblast da değildir. Bu durum açıkça kabul edilmeden, normal primer fibroblast hücre döngüsü davranışının modeli olarak kullanılmamalıdır.

Morfoloji ve büyüme. DF-1 hücreleri yapışkan (adherent), iğsi biçimli fibroblastlardır; konflüensde fibroblast kültürlerine özgü paralel dizilim görünümüyle tek tabaka oluştururlar. Primer CEF'e kıyasla belirgin biçimde daha hızlı büyür ve etkin biçimde transfekte edilirler — ikisi de rutin çalışmada pratik üstünlüklerdir.

Standart besiyeri. Yüksek glukozlu Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri, %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş hâlde, 37 °C ve %5 CO2 koşullarında. Yayımlanmış DF-1 çalışmalarının çoğunda kullanılan koşul budur ve makul bir varsayılandır.

Sıcaklık üzerine. Tavuğun vücut sıcaklığı yaklaşık 41 °C'dir ve bazı aviyan viroloji protokolleri, konak koşullarını daha iyi temsil etmek için DF-1'i ya da belirli virüsleri 38,5-39 °C'de çoğaltır. DF-1 bu aralığı tolere eder. Kullandığınız virüs veya deney yükseltilmiş sıcaklık gerektirmiyorsa, 37 °C standarttır ve literatürün büyük bölümüyle doğrudan karşılaştırılabilir. Hangisini seçerseniz seçin, bir deney boyunca sabit tutun ve yöntem bölümünde belirtin; çünkü bazı aviyan virüslerde replikasyon kinetiği 37 °C ile 39 °C arasında ölçülebilir biçimde farklılaşır.

Takviyeler. Bazı protokoller FBS'nin bir bölümünün yanında ya da yerine %2-10 tavuk serumu ekler, bazıları da triptoz fosfat buyyonu katar; her ikisi de primer CEF uygulamasından devralınmıştır. Rutin DF-1 büyümesi için ikisi de zorunlu değildir.

Pasajlama. DF-1 standart bir yapışkan hattır ve alışılmış biçimde pasajlanır: kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ya da DPBS ile yıkayın, Trypsin-EDTA ile ayırın, serum içeren besiyeri veya tanımlı bir tripsin inhibitörü ile nötralize edin ve yeniden ekim yapın. Haftada iki kez uygulanan 1:3-1:8 bölme oranları çoğu laboratuvar programına uyar.

Kültürlerin aşırı büyümesine izin vermeyin. Uzun süre konflüensde tutulan fibroblastlar davranış değiştirir; tekrar tekrar yoğun biçimde aşırı büyümeye bırakılmış DF-1 kültürleri transfeksiyon verimini yitirir ve virüs replikasyonunu daha kötü destekler. Tek tabaka sıkıca kapanmadan önce pasajlayın.

Pasaj numarası. Ölümsüzleşmiş bir hat bile sürüklenir. Erkenden bir çalışma bankası kurun, pasaj numarasını kaydedin ve bir kültürü sınırsızca sürdürmek yerine dondurulmuş stoğa dönün. Okumanın virüs titresi olduğu her çalışmada pasaj aralığını sabit tutun; çünkü yüksek pasajlı ve düşük pasajlı hücrelerden elde edilen titreler her zaman karşılaştırılabilir değildir.

Kriyoprezervasyon. DF-1 standart koşullarda iyi donar ve iyi toparlanır: kriyoprotektan olarak DMSO içeren, serumlu ya da tanımlı bir dondurma besiyeri, dakikada yaklaşık 1 °C hızla -80 °C'ye denetimli soğutma ve ardından uzun süreli saklama için sıvı azotun buhar fazına aktarma.

Varsayılan DMEM artı %10 FBS formülasyonu işini görür; ancak üretime doğru giden herhangi bir çalışma için yanlış başlangıç noktasıdır ve DF-1'e özel serumsuz besiyerleri iyi nedenlerle vardır.

Özellikle bu hücre hattında serumdan neden uzaklaşmalı:

• Aşı ve biyolojik ürün üretimi. DF-1, aviyan aşı üretiminde ve rekombinant virüs üretiminde substrat olarak kullanılır. Sığır kaynaklı bir hammaddenin çıkarılması, bir yabancı etken bulaş yolunu ortadan kaldırır ve hem düzenleyici dosyayı hem de tedarik zincirini basitleştirir. Baskın itici güç budur.
• Virüs saflaştırma. Serum, aşağı akışta virüsten ayrılması gereken geniş ve değişken bir protein arka planı katar. Serumsuz bir hasadın berraklaştırılması ve saflaştırılması belirgin biçimde daha kolaydır; özellikle yoğunluk gradyanına ya da kromatografi kolonuna verilecek bir ürün için.
• Titre tutarlılığı. Virüs titresi konak hücrenin fizyolojik durumuna duyarlıdır ve partiler arası serum değişkenliği doğrudan titre değişkenliğine dönüşür. Serumun kaldırılması, zaten gürültülü olan bir ölçümden denetimsiz bir girdiyi çıkarır.
• Ölçek ekonomisi. Tezgâh ölçeğinin üzerinde serum, kayda değer bir maliyet kalemi ve bir tedarik riskidir.

DF-1 formülasyonları tipik olarak hayvansal kaynak içermez, sürece göre süspansiyon veya yapışkan çalışmaya uygun biçimde tamponlanmıştır ve L-glutamin ya da daha kararlı dipeptit olan L-alanil-L-glutamin ile sunulur; bu ayrıntı önemlidir, çünkü glutamin çözeltide toksik olan ve biriken amonyağa parçalanır, dipeptit biçimi ise bunu belirgin ölçüde azaltır. Besiyerini kurum içinde hazırlamanın sıvı sevkiyattan daha ekonomik olduğu ölçek büyütme senaryoları için toz formatlar da mevcuttur.

Adaptasyon. Hücreleri tek adımda değil kademeli olarak geçirin — serumu birkaç pasaj boyunca basamaklı olarak azaltın ve her aşamada büyüme hızı ile canlılığın toparlanmasını bekleyin. Adaptasyon başarısız olursa diye başlamadan önce hücreleri bankalayın ve adapte olmuş hattı kararlı hâle gelir gelmez yeniden bankalayın. Pasajlama için tanımlı bir tripsin inhibitörüne ya da rekombinant bir ayırma reaktifine gereksinim duymayı bekleyin; çünkü serum yokken tripsinizasyonu durduracak proteaz inhibitörü de yoktur. Serumunu yitiren yapışkan hücreler aynı zamanda fibronektin ve vitronektini de yitirir, dolayısıyla kaplanmış bir yüzey gerekebilir.

Adaptasyondan sonra yeniden doğrulayın. Yeni sürece güvenmeden önce, serumsuz sistemdeki virüs replikasyonunun ve titresinin serumla elde ettiğinizle örtüştüğünü doğrulayın. Hücreler yeni bir besiyerinde gayet iyi büyürken virüs replikasyonunu farklı biçimde destekleyebilir.

Primer tavuk embriyo fibroblastlarının yerini almak. Primer CEF, spesifik patojen içermeyen yumurtalardan alınan embriyoların ayrıştırılmasıyla hazırlanır ve süregelen pratik sorunları vardır: güvenilir bir SPF yumurta tedariki gerektirir, emek yoğundur, ömrü sınırlı olduğu için hücrelerin tekrar tekrar hazırlanması gerekir ve — literatürde en sık dile getirilen nokta — virüs titreleri partiden partiye dalgalanır. DF-1 bunların hepsini ortadan kaldırır. Sürekli olarak elde edilebilir, hazırlıklar arasında tutarlı davranır ve genetik arka planı sabittir.

Aviyan lökoz ve sarkom virüsü çalışmaları. Hattın ev içermeyen arka planı asıl bu uygulama için oluşturulmuştur. DF-1, aviyan lökoz virüslerinin saptanmasında primer CEF'in yerine benimsenmiştir; endojen provirüsün yokluğu, test sinyalinin kesin biçimde ekzojen virüsü yansıtması anlamına gelir. Ayrıca bazı başka sistemlerde zayıf üreyen bir alt grup olan ALV-J'yi de destekler. Bununla bağlantılı olarak DF-1, aviyan ve gelişim biyolojisinde gen aktarımı için kullanılan ALV kökenli aviyan vektör sistemi olan RCAS temelli retroviral vektörlerin standart konağıdır.

Genel olarak virüs çoğaltma. DF-1, aviyan influenza (hem düşük patojenik hem yüksek patojenik izolatlar), enfeksiyöz bursal hastalık virüsü, aviyan reovirüsler, Newcastle hastalığı virüsü, Marek hastalığı virüsü ve çiçek (fowlpox) dâhil geniş bir aviyan virüs yelpazesinin replikasyonunu destekler. Bunların birkaçında replikasyon, primer CEF'teki ile karşılaştırılabilir ya da ondan yüksektir.

Aşı geliştirme ve üretimi. DF-1, aviyan aşılar için substrat olarak CEF temelli hazırlıklarla doğrudan karşılaştırılmış; buna spesifik patojen içermeyen tavuklarda enfeksiyöz bursal hastalık aşılarının güvenliği, immünojenitesi ve etkinliğine ilişkin karşılaştırmalı çalışmalar da dâhildir. Sürekli, iyi karakterize edilmiş ve endojen virüs içermeyen bir substratın nitelenmesi ve denetlenmesi, her seferinde yumurtadan taze hazırlanan bir primer hücreye kıyasla çok daha kolaydır.

Rekombinant protein ve virüs üretimi. Yüksek transfeksiyon verimi ve hızlı büyüme, DF-1'i rekombinant aviyan virüslerin üretiminde ve — doğru katlanmanın ve aviyan tipte translasyon sonrası modifikasyonun önem taşıdığı durumlarda — aviyan proteinlerin homolog bir konakta ifade edilmesinde kullanışlı kılar.

DF-1 virüs replikasyonunu iyi destekler ve bunun bir nedeni, doğuştan antiviral yanıtının primer CEF'e göre zayıflamış olmasıdır. Bu hem hattın pratik üstünlüğü hem de immünoloji çalışmalarında kullanmadan önce anlaşılması gereken bir sınırlamadır.

Yayımlanmış çalışmalar, DF-1 hücrelerinde sitokin sinyalinin negatif düzenleyicisi olan tavuk SOCS1'inin yapısal olarak yüksek düzeyde bulunduğunu — bazal ifadesinin primer CEF'tekinden yaklaşık 16 kat yüksek olduğunun bildirildiğini — ve bunun hattaki doğuştan yanıtları baskıladığını göstermiştir. Yüksek patojenik H5N1 ve düşük patojenik H9N2 aviyan influenza virüsleriyle enfeksiyon sonrasında doğuştan bağışıklık genlerinin ifadesini inceleyen karşılaştırmalı çalışmalar bu yanıtları DF-1'de ayrıntılı olarak tanımlamıştır.

Pratikte bunun sonuçları:

• Virüs üretmek için bu bir üstünlüktür. İnterferon yanıtı sönümlenmiş bir konak, daha yüksek replikasyona ve daha tekrarlanabilir titrelere izin verir. DF-1'in CEF titrelerine eşit ya da onların üzerinde olma ününün bir kısmı, gerçek anlamda üstün duyarlılıktan değil bundan kaynaklanır.
• Doğuştan bağışıklığı incelemek için ciddi bir karıştırıcı etkendir. DF-1'de elde edilen interferon indüksiyonu, sitokin sinyali ve antiviral gen ifadesi sonuçları, primer CEF'e ya da hayvana doğrudan aktarılamaz. Bu tür çalışmalar primer hücrelerde doğrulanmalı, makaleler hangi sistemin neden kullanıldığını belirtmelidir.
• Daha genel olarak konak-patojen etkileşimi çalışmalarında, yukarıda anılan değişmiş p53 ve E2F-1 işlevini de unutmayın. DF-1 mükemmel bir üretim ve çoğaltma konağı, buna karşılık normal fibroblast fizyolojisinin kusurlu bir modelidir.

Bunların hiçbiri DF-1'i kullanmamak için bir gerekçe değildir. Sistemi soruya uydurmak gerektiğinin gerekçesidir — ki bu, ölümsüzleşmiş her hat için geçerli olan aynı gerekçedir ve yalnızca bu hat için alışılmadık ölçüde iyi belgelenmiştir.

Tedarik. DF-1'i, belgelenmemiş bir laboratuvardan laboratuvara aktarım yerine, kökeni belgelenmiş yerleşik bir hücre bankasından edinin. Burada köken bilgisi her zamankinden önemlidir; çünkü hattın tanımlayıcı özelliği — endojen retrovirüsten yoksun olması — tam olarak hücrelere bakarak doğrulanamayacak türden bir şeydir.

Kimliklendirin ve test edin. Teslim alırken kimliği doğrulayın ve bankalamadan önce mikoplazma testi yapın. Mikoplazma virüs replikasyonunu ve titresini değiştirir; bir virüs çoğaltma konağı için bu, birincil okumanıza yönelik doğrudan bir tehdittir.

Düzgün bankalayın. Düşük pasajda bir ana banka ve ondan bir çalışma bankası kurun ve çalışma bankasından ilerleyin. Bu her hat için standart uygulamadır, ama değeri hazırlıklar arası tutarlılığında yatan bir hat için özellikle değerlidir.

Titrenin kritik olduğu çalışmalarda pasaj aralığını sabit tutun ve titre verisinin yanına pasaj numarasını kaydedin.

Besiyerini izleyin. Glutamin çözeltide parçalanır ve amonyak üretir; biriken amonyağın hem hücreleri hem virüs verimini etkileyebildiği uzun enfeksiyonlarda taze bir besiyeri partisi ya da kararlı hâle getirilmiş dipeptit glutamin kaynağı kullanın.

Biyogüvenlik. DF-1'in kendisi standart hücre kültürü koşullarını gerektirir. Herhangi bir çalışmanın kapsama düzeyini hücre hattı değil, çoğaltılan virüs belirler — yüksek patojenik aviyan influenza ve benzeri etkenler kendi çok daha yüksek gerekliliklerini ve kendi düzenleyici izinlerini beraberinde getirir. Herhangi bir çoğaltma çalışmasına başlamadan önce geçerli kapsama düzeyini ve yetkilendirmeyi doğrulayın.