Hücre Kültüründe Esansiyel ve Esansiyel Olmayan Amino Asitler

Terminoloji beslenme biliminden ödünç alınmıştır ama liste aynı değildir; bu konudaki kafa karışıklığının çoğunun kaynağı da budur.

Hücre kültüründe bir amino asit, flaskınızdaki hücreler onu yeterli miktarda sentezleyemiyorsa ve besiyerinde bulunmadığında üreme duruyorsa işlevsel olarak esansiyeldir. Harry Eagle bu listeyi 1950'lerde bileşenleri teker teker çıkarıp hücrelerin hangi eksikliğe dayanamadığını gözleyerek deneysel olarak belirlemiştir.

Hücre kültürü açısından esansiyel küme on üç amino asittir: L-arjinin, L-sistin, L-glutamin, L-histidin, L-izolösin, L-lösin, L-lizin, L-metiyonin, L-fenilalanin, L-treonin, L-triptofan, L-tirozin ve L-valin.

Bunlardan dördü — arjinin, sistin, tirozin ve glutamin — beslenme açısından esansiyel sayılmaz, çünkü bütün bir organizmanın, flasktaki tek tabakada bulunmayan dokuları ve yolakları vardır. Kültür hücreleri bu amino asitleri sağlayan organlar arası metabolizmadan yoksundur; dolayısıyla besiyerinin bakış açısından onların dışarıdan verilmesi gerekir. Eski literatürü okurken bu ayrımda titiz olmakta fayda var: tirozini esansiyel olmayan diye tanımlayan bir makale neredeyse kesinlikle beslenme tanımını kullanıyordur, kültür tanımını değil.

Ticari bir MEM Esansiyel Amino Asitler 50X takviyesi on üç amino asidin on ikisini içerir. Glutamin dışarıda bırakılır ve ayrıca eklenir; nedenleri aşağıda anlatılıyor.

Hücre kültüründe kullanılan esansiyel olmayan küme tam olarak yedi tanedir: glisin, L-alanin, L-asparajin, L-aspartik asit, L-glutamik asit, L-prolin ve L-serin. MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler adıyla satılan her ürünün içeriği budur.

Standart 100X formülasyon yedisini de 10 mM'de taşır — glisin 750 mg/L, L-alanin 890, L-asparajin 1320, L-aspartik asit 1330, L-glutamik asit 1470, L-prolin 1150 ve L-serin 1050. Litre başına 10 mL eklenerek 1:100 seyreltildiğinde her biri 0,1 mM son konsantrasyona iner. Konsantrenin yedisinde de temiz bir 10 mM olması bilinçli bir tercihtir ve hesabı önemsiz kılar: 1X her zaman her birinden 0,1 mM demektir.

İçinde ne olmadığına dikkat edin. Bir NEAA takviyesinde glutamin yoktur, sistein de yoktur. Bir protokol NEAA ve glutamin eklenmesini söylüyorsa bunlar iki ayrı eklemedir; birini yapmak diğerinin yerine geçmez.

Bu makul bir itiraz ve dört yanıtı var.

Biyosentez bedava değildir. Bir amino asidi sıfırdan üretmek, merkezi metabolizmadan çekilen karbon iskeletlerini, ATP'yi ve indirgeyici eşdeğerleri tüketir. Hızla çoğalan bir kültürde bunlar, biyokütle inşa etmek için kullanılan kaynakların ta kendisidir. Amino asidi hazır vermek, hücrelerin bu bütçeyi üremeye harcamasını sağlar; olağan sonuç bir miktar daha yüksek üreme hızı ve daha yüksek ulaşılabilir yoğunluktur.

Bazı hatlar onları gerçekten üretemez. "Esansiyel olmayan" nitelemesi tipik memeli hücresini tanımlar, her hücre hattını değil. CHO-K1, pirolin-5-karboksilat sentaz eksikliği nedeniyle prolin oksotrofudur ve besiyerinde prolin bulunmasını doğrudan gerektirir; eksik enzimin ifade edilmesi prolin bağımsızlığını geri kazandırır. Bu bir merak konusu değildir — CHO hücreleri için geliştirilmiş besiyeri olan Ham's F-12'nin prolini, diğer altısının üç katı olan 0,3 mM'de taşımasının nedeni tam olarak budur. Benzer biçimde, asparajin sentetaz aktivitesi düşük olan hatlar dışarıdan verilen asparajine bağımlıdır.

Bazıları protein yapmaktan fazlasını yapar. Serin ve glisin, folat döngüsü üzerinden tek karbon metabolizmasını besler ve nükleotit sentezi ile metilasyon tepkimeleri için birim sağlar. Çoğalan bir hücrenin serin talebi, rahatça sentezleyebildiği miktarı aşabilir; ikisi birbirine dönüşebildiği için de çoğu zaman birlikte kısıtlayıcı olurlar.

Besiyerinde bulunması alımı garanti etmez. Özellikle aspartat birçok memeli hücresi tarafından zayıf taşınır; dolayısıyla besiyerindeki konsantrasyonu, hücre içindeki kullanılabilirliğinin zayıf bir göstergesidir. Aspartat içeren bir besiyerinin bu gereksinimi karşıladığı sonucuna varmadan önce bunu hatırlamakta fayda var.

Bütün bunlara karşılık takviye ucuzdur ve besiyerine yaklaşık 0,7 mOsm/kg ekler; bu da tipik bir 280–320 mOsm/kg yanında ihmal edilebilir. Gerekmediği halde eklemenin bedeli düşüktür; gerekliyken atlamanın bedeli ise iki hafta boyunca nedenini aradığınız yavaş bir kültürdür.

Pratik soru budur ve yanıt çoğu kişinin beklediğinden çok daha fazla değişir. Aşağıdaki karşılaştırma tablosu tam dökümü veriyor; özeti şu:

MEM (Eagle) yedisinden hiçbirini içermez. Bu tasarım gereğidir — o, minimum esansiyel besiyeridir ve NEAA takviyesi tam da onu tamamlamak için vardır. ATCC'den gelen EMEM etiketli bir şişenin esansiyel olmayan amino asitleri içerdiğine, bir Gibco MEM'in ise içermediğine dikkat edin; yani tek başına "MEM" size bir şey söylemez.

DMEM ikisini içerir: glisin ve L-serin, ikisi de 0,4 mM'de. Diğer beşinden hiçbirini taşımaz. Bu nedenle DMEM, özellikle HEK293 çalışmaları, transfeksiyon ve virüs üretimi söz konusu olduğunda NEAA takviyesi için sık başvurulan bir adaydır.

RPMI 1640 yedisinden altısını içerir, üstelik birbirinden farklı konsantrasyonlarda — asparajin 0,379 mM, serin 0,286, prolin 0,174, aspartik asit 0,150, glutamik asit 0,136 ve glisin 0,133. İçinde L-alanin yoktur. RPMI'yi takviye ediyorsanız, kümeden gerçekten eksik olan tek üye alanindir.

Ham's F-12 yedisini de içerir; altısı tam olarak 0,1 mM'de, prolin ise 0,3 mM'de — yani 1X'lik bir NEAA eklemesinin vereceği çalışma düzeyiyle aynı. F-12'yi NEAA ile takviye etmek normalde gereksizdir.

IMDM yedisini de içerir ve genellikle F-12'den daha yüksek düzeylerde: glutamik asit 0,510 mM, glisin ve serin 0,4, prolin 0,348, alanin 0,281, aspartik asit 0,226 ve asparajin 0,189.

DMEM/F-12 yedisini de içerir; DMEM ile 1:1 karışım olduğu için konsantrasyonlar kabaca F-12'nin yarısı kadardır.

MEM alpha da bunları içerir, düz MEM'e göre zenginleştirilmesinin bir parçası olarak.

Glutamin esansiyel listede yer alır ama listedeki hiçbir şeye benzemeyen bir davranış gösterir; sorun çıkarma ihtimali en yüksek amino asit de odur.

Hücreler onu biyosentez için başlıca azot vericisi olarak ve glutaminoliz yoluyla TCA döngüsünü besleyen önemli bir karbon kaynağı olarak kullanır. Talep yüksektir — MEM 2 mM, DMEM 4 mM taşır; bu da diğer amino asitlerin çoğundan bir büyüklük mertebesi daha fazladır.

Ayrıca sulu çözeltide kimyasal olarak kararsızdır. Serbest L-glutamin kendiliğinden pirolidon karboksilik aside halkalaşır ve amonyak açığa çıkarır; tepkime 37 °C'de soğuktakinden daha hızlı ilerler. Bundan iki sorun doğar: besiyeri, raf ömrü boyunca ve inkübasyon sırasında glutamin kaybeder; biriken amonyak ise birçok hücre hattı için baskılayıcıdır.

Üç standart çözüm vardır. Glutaminsiz besiyeri alıp dondurulmuş 100X ya da 200X stoktan taze eklemek — geleneksel yaklaşım budur. Çözeltide kararlı olan ve hücre yüzeyi peptidazlarınca gerektikçe parçalanarak glutamini serbest bırakan bir dipeptit formu — L-alanil-L-glutamin ya da L-glisil-L-glutamin — kullanmak; böylece hem kayıp hem de amonyak sıçraması önlenir. Ya da dipeptidi zaten içeren, çoğu katalogda birkaç örneği bulunan bir besiyeri satın almak.

Bu sayfa açısından pratik nokta şudur: glutamin bir NEAA takviyesiyle asla karşılanmaz ve aylardır rafta duran bir tam besiyeri şişesiyle de nadiren yeterince karşılanır. Bir kültür, aylardır bekleyen bir besiyerinde kötü üriyorsa, ilk kontrol edilecekler arasında glutamin vardır.

NEAA eklemek. Litre besiyeri başına 100X takviyeden 10 mL ekleyin; yedisinin her birinden 0,1 mM elde edersiniz. Tam besiyerine bir kez, serum ve glutamin eklediğiniz anda ekleyin ve bunu ara sıra yapılan bir ilave olarak değil, formülasyonun parçası olarak kayda geçirin — partiler arasında tutarsız takviye, yaygın ve tamamen önlenebilir bir değişkenlik kaynağıdır.

Genellikle fayda gören besiyerleri: yedisinden hiçbirini ya da yalnızca ikisini taşıyan MEM ve DMEM. DMEM'in NEAA ile takviyesi; insan pluripotent kök hücre kültürü, HEK293 tabanlı transfeksiyon ve virüs üretimi, hibridoma çalışmaları ve mezenkimal stromal hücreler için rutindir.

Genellikle gereksiz olduğu besiyerleri: Ham's F-12, IMDM ve DMEM/F-12 yedisini de çalışma konsantrasyonlarında taşır. Bu düzeylerde daha fazlasını eklemek zararlı değildir, ama bir işe de yaramaz; üstelik formülasyonunuzu yeniden üretmeyi zorlaştırır.

RPMI 1640 ilginç ara durumdur — yedisinden altısına sahiptir ve yalnızca alanin eksiktir; dolayısıyla tam bir NEAA eklemesi çoğunlukla zaten var olanın üzerine ekleme yapar.

NEAA'yı kötü giden bir kültürün kurtarıcısı olarak görmeyin. Hücreler kötü üriyorsa; kontaminasyon, glutamin bozunması, serum partisi, pH ve mikoplazma çok daha olası açıklamalardır; zaten yeterli olan bir besiyerine amino asit eklemek işe yaramaz. Aynı anda tek bir değişkeni değiştirin.

İki takviyeyi birbirine karıştırmayın. MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler 100X, yedisini 0,1 mM'de sağlar. MEM Esansiyel Amino Asitler 50X ise glutamin dışındaki on iki esansiyel amino asidi sağlar ve tam bir formülasyona rutin biçimde eklenmek için değil, besiyerini güçlendirmek ya da yeniden oluşturmak için vardır. Birbirlerinin yerine geçmezler ve konsantreler farklı kuvvetlerdedir.