Hemositometre ile Hücre Sayımı

Hücre kültüründe kullanılan hemositometre neredeyse her zaman improved Neubauer (geliştirilmiş Neubauer) desenidir. Kalın bir cam lamdır; üzerinde, hendeklerle birbirinden ayrılmış, aynı çizgili ızgarayı taşıyan iki parlatılmış sayım platformu bulunur. İki yandaki yükseltilmiş omuzlar lameli çizgili yüzeyin tam 0.1 mm üzerinde tutar; iki boyutlu bir sayımı hacim ölçümüne çeviren şey, işte bu sabit derinliktir.

Çizgili alan 3 mm x 3 mm = 9 mm2 olup 1 mm x 1 mm'lik dokuz kareye bölünmüştür:

• Dört köşe karesi, her biri 0.25 x 0.25 mm olan 16 kareye ayrılmıştır. Memeli hücrelerinin sayımında kullanılan kareler bunlardır.
• Orta kare, 0.2 x 0.2 mm'lik 25 orta kareye bölünmüştür; bunların her biri de 0.05 x 0.05 mm'lik 16 küçük kareye ayrılır — toplamda 400 küçük kare. Bu daha ince bölüntü, eritrositler ve trombositler gibi küçük ve çok sayıda parçacık için düşünülmüştür.

Hacimler doğrudan alan x 0.1 mm derinlikten çıkar:

Meşhur x 10^4 çarpanının kaynağı, 1 x 10^-4 mL değeridir. Bir köşe karesindeki hücre sayımı, bir mililitrenin on binde birindeki sayımdır; dolayısıyla 10.000 ile çarpmak onu mL başına hücreye çevirir. Çarpanın başka bir açıklaması yoktur ve farklı derinlikte bir odacıkta sayarsanız değişir — bazı tek kullanımlık odacıklar 0.02 mm veya 0.1 mm derinliğindedir ve ambalajında yazan farklı bir çarpan taşır.

Improved Neubauer'de 1 mm2'lik karelerin sınırları üçlü çizgi hâlinde çizilmiştir. Sayım açısından sınır, üçlünün ortadaki çizgisidir. Bu, sessiz hataların yaygın bir kaynağıdır: dış çizgiye kadar saymak alanı, dolayısıyla sayımı yüzde birkaç oranında şişirir.

1. Odacığı ve lameli temizleyin. %70 etanol ile silin ve tüy bırakmayan bir kâğıtla kurulayın. Sıradan bir mikroskopi lameli değil, hemositometreyle birlikte verilen kalın, taşlanmış lameli kullanın — sıradan lamel bükülür ve odacık derinliği artık 0.1 mm olmaz.
2. Lameli yerine oturtun. Omuzlara hafifçe nefes vererek nemlendirin, sonra lameli sıkıca bastırın. Doğru oturduğunda, camın cama değdiği yerde Newton halkaları — soluk girişim saçakları — belirir. Odacık derinliğinin doğru olduğunu güvenilir biçimde gösteren tek işaret budur.
3. Gerçek bir tekli hücre süspansiyonu elde edin. Kümeler sayımı anlamsız kılar. Yeterince tripsinleyin, dağıtmak için nazikçe pipetleyin ve hücre hattı kümelenmeye yatkınsa hücre süzgecinden geçirin.
4. Örnek almadan hemen önce karıştırın. Hücreler bir dakika içinde çöker. Tüpü birkaç kez alt üst edin veya pipetle çekip bırakın, alikotu hemen orta derinlikten alın.
5. Tripan mavisi ile seyreltin. Standart olan 1:1 karışımdır — örneğin 50 mikrolitre hücre süspansiyonu artı 50 mikrolitre %0,4 tripan mavisi, yani seyreltme faktörü 2. Nazikçe karıştırın ve 3-5 dakika içinde sayın: tripan mavisi sitotoksiktir; karışım beklerse canlı hücreler de boyayı almaya başlar ve canlılık yapay olarak düşük okunur.
6. Odacığı doldurun. Yaklaşık 10 mikrolitre alın, pipet ucunu lamelin kenarındaki çentiğe değdirin ve örneğin kılcal etkiyle içeri çekilmesini bekleyin. Her odacığı tek ve kesintisiz bir hareketle doldurun.
7. Doluluğu kontrol edin. Çizgili alan kabarcıksız ve düzgün biçimde kaplanmış olmalıdır. Sıvı hendeklere kaçmışsa lamel omuzlarından yüzmüş demektir ve derinlik yanlıştır — temizleyin, kurutun ve yeniden yükleyin. Az doldurma ise kuru bölgeler bırakır ve sayımı ters yönde saptırır.
8. Saymadan önce hücrelerin yaklaşık 1 dakika çökmesini bekleyin, böylece hepsi tek bir odak düzleminde bulunur.

Kültürdeki memeli hücreleri için 1 mm2'lik dört köşe karesini sayın. Bazı laboratuvarlar orta kareyi de ekleyerek beş kare sayar. Her iki uygulama da geçerlidir; geçerli olmayan, ikisi arasında gidip gelmektir, çünkü ikisi farklı örnekleme istatistiği verir.

Sınır çizgisi kuralı, çizgi üzerinde duran bir hücrenin aksi hâlde iki komşu karede birer kez sayılması ya da tümüyle atlanması nedeniyle vardır. Kural basittir:

Karenin birbirine komşu iki kenarına değen hücreleri sayın — bir "L" biçimi — diğer iki kenara değenleri saymayın.

En yaygın uygulama üst ve sol çizgileri dâhil etmek, alt ve sağ çizgileri dışlamaktır; ayna görüntüsü olan uygulama, yani üst ve sağı dâhil etmek de aynı ölçüde doğrudur. Birini seçin, SOP'unuza yazın ve her karede, her operatör için aynı şekilde uygulayın. Bir hücre, gövdesinin çoğunluğunun üçlü çizginin ortadaki çizgisine göre nerede durduğuna bakılarak değerlendirilir.

Uygulamada iki kural daha önemlidir:

• Her iki odacık. Lamın iki tarafını da doldurun ve sayın. İki sayım kabaca %10 içinde uyuşmalıdır. Uyuşmuyorsa süspansiyon düzgün karışmamıştır, odacık eşit dolmamıştır ya da hücreler kümelenmektedir — kötü bir çiftin ortalamasını almak yerine yeniden yükleyin.
• Yoğunluk penceresi. 1 mm2'lik köşe karesi başına kabaca 25 ila 100 hücre hedefleyin; bu, seyreltme sonrasında yaklaşık 2.5 x 10^5 ile 1 x 10^6 hücre/mL arasındaki bir süspansiyona karşılık gelir. Kare başına yaklaşık 25'in altında sayıma örnekleme gürültüsü hâkim olur; yaklaşık 100'ün üzerinde hücreler üst üste biner ve sistematik olarak eksik sayılır. Süspansiyon çok yoğunsa daha fazla seyreltin ve ek faktörü kaydedin.

Kesinlik sınırı insana değil, istatistiğe bağlıdır. Hücre sayımı Poisson istatistiğine uyar; bu nedenle varyasyon katsayısı, sayılan toplam hücre sayısı N olmak üzere yaklaşık 1/sqrt(N) kadardır. 100 hücre saymak yaklaşık %10 CV verir; 200 hücre yaklaşık %7; 400 hücre yaklaşık %5. Tek bir karede 30 hücreyle ne kadar özenli çalışırsanız çalışın bunu aşamazsınız — daha dar bir sayıma giden tek yol, daha çok hücre saymaktır.

Formül şudur:

Hücre/mL = (sayılan toplam hücre / sayılan kare sayısı) x seyreltme faktörü x 10^4

Seyreltme faktörü, toplam hacmin içindeki hücre süspansiyonu hacmine bölünmesiyle bulunur. Tripan mavisiyle 1:1 karışım 2 seyreltme faktörü demektir, 1 değil. Hücre sayımında en sık yapılan aritmetik hata budur.

Sayısal örnek. HeLa hücreleri içeren bir T-75 flask tripsinlenmiş ve 10.0 mL tam besiyeri içinde yeniden süspanse edilmiştir. Bu süspansiyondan 50 mikrolitre, 50 mikrolitre %0,4 tripan mavisi ile karıştırılır (SF = 2) ve 10 mikrolitresi yüklenir. Dört köşe karesi şunu verir:

Canlı hücre derişimi

84.0 x 2 x 10^4 = 1.68 x 10^6 canlı hücre/mL

Toplam (canlı + ölü) derişim

(84.0 + 4.5) x 2 x 10^4 = 1.77 x 10^6 hücre/mL

Hasat edilen toplam canlı hücre

1.68 x 10^6 hücre/mL x 10.0 mL = 1.68 x 10^7 canlı hücre

Canlılık

336 / (336 + 18) x 100 = %94,9

Seyreltme faktörünün canlılık hesabında sadeleştiğine, bu yüzden orada yer almadığına dikkat edin. Ayrıca 336 hücrelik bir sayım yaklaşık %5,5 CV verir; dolayısıyla derişim doğru biçimde 1.7 x 10^6 hücre/mL olarak bildirilir — 1.68 x 10^6 demek, yöntemin sahip olmadığı bir kesinliği ima eder.

Her köşe karesinde 76 ila 91 hücre vardı, yani 25-100 penceresinin içinde; bu nedenle ek seyreltmeye gerek kalmadı.

Tripan mavisi, sağlam bir plazma zarını geçemeyen anyonik bir diazo boyadır. Zarı bozulmuş hücreler boyayı alır ve belirgin biçimde mavi, çoğu zaman şişkin görünür; canlı hücreler boyayı dışlar ve net sınırlı, parlak, ışığı kıran hücreler olarak görünür. Standart çalışma çözeltisi, serum fizyolojik veya PBS içinde %0,4 (a/h) derişimindedir.

Bunun ölçtüğü şey zar bütünlüğüdür ve bu, günlük dildeki "canlılık" kavramından daha dardır. Apoptoza girmiş ama zarı hâlâ sağlam olan bir hücre, tripan mavisine göre canlı sayılır. Tripsinleme sırasında mekanik olarak zarar görmüş bir hücre ise, geldiği popülasyon sağlıklı olsa bile ölü sayılır. Tripan mavisi dışlaması, rutin hasat kontrolü için doğru araçtır; bir sitotoksisite deneyinin sonucunu ölçmek için ise yanlış araçtır — orada apoptoza özgü ya da metabolik bir test gerekir.

Uygulamaya dönük noktalar:

• Süre önemlidir. Karıştırdıktan sonra 3-5 dakika içinde sayın. Tripan mavisi kendisi de toksiktir ve uzun temas hücreleri öldürerek canlılık değerini aşağı çeker.
• Protein karışır. Tripan mavisi serum proteinine bağlanır; bu da zemini boyar ve ayrımı zorlaştırır. Zemin belirgin biçimde maviyse, saymadan önce hücreleri PBS içine yıkayın.
• Temiz biçimde hasat edilmiş, logaritmik fazdaki sağlıklı bir kültürden %90'ın üzerinde bir değer bekleyin. %70-85 arası bir sonuç aşırı tripsinlemeye, aşırı konflüent bir flaska, sert pipetlemeye ya da hücreler kullanılmadan önce araştırılması gereken bir kültür sorununa işaret eder.
• Döküntü, ölü hücre değildir. Küçük ve düzensiz mavi parçacıklar zar döküntüsüdür ve sayılmamalıdır. Yalnızca makul hücre boyutunda ve biçiminde olan nesneleri sayın.

Sayım, ancak pipetlenecek bir hacme dönüştürüldüğünde işe yarar. Yukarıdaki sayısal örneği sürdürürsek süspansiyon 1.68 x 10^6 canlı hücre/mL'dir.

Görev: 6 kuyucuklu bir plakayı, kuyucuk başına 2 mL besiyeri içinde 2 x 10^5 hücre olacak şekilde ekmek.

1. Hedef derişim. 2 mL içinde 2 x 10^5 hücre = 1 x 10^5 hücre/mL.
2. Gereken toplam hacim. Altı kuyucuk x 2 mL = 12 mL. Pipetleme kayıplarını karşılamak için 13 mL hazırlayın.
3. Gereken toplam hücre. 13 mL x 1 x 10^5 hücre/mL = 1.3 x 10^6 hücre.
4. Stok süspansiyon hacmi. 1.3 x 10^6 / 1.68 x 10^6 hücre/mL = 0.774 mL = 774 mikrolitre.
5. Tamamlayın. 774 mikrolitre hücre süspansiyonunu 12.23 mL önceden ısıtılmış tam besiyerine ekleyin, nazikçe karıştırın ve kuyucuk başına 2 mL dağıtın.
6. Eşit dağıtın. Plakayı inkübatöre koymadan önce ileri geri, ardından sağa sola sallayın. Daire çizerek çalkalamak hücreleri her kuyucuğun ortasına toplar.

Aynı aritmetik, sayımın bütün sonraki kullanımlarını yönetir: belirli bir hücre/cm2 değerinde flasklara çoğaltma, viyal başına belirli bir hücre/mL değerinde kriyoprezervasyon ve test plakalarının ekimi. Derişimi çalışma sayısı olarak hücre/mL cinsinde tutun ve dönüşümü en sonda bir kez yapın.

Kümeler. En zararlı hata, çünkü sayımı hata gibi görünmeden saptırır. Kümelenmiş hücreler eksik sayılır, ekim yoğunlukları düşük çıkar ve sonuçlar tekrarlanamaz olur. Nedenleri eksik tripsinleme, parçalanmış hücrelerden salınan DNA ve yetersiz karıştırmadır. Çözüm: ayrıştırma süresini biraz uzatmak, nötralizasyon besiyerine DNaz eklemek, dağıtmak için nazikçe pipetlemek veya süzmek. Kümelenmiş bir süspansiyonu saymaya çalışmayın; yeniden hazırlayın.

Hendeklerde sıvı. Lamel yüzmüştür ve odacık artık 0.1 mm derinliğinde değildir; dolayısıyla ondan türetilen her sayı yanlıştır. Temizleyin, kurutun, Newton halkaları belirene kadar lameli yeniden oturtun ve tekrar yükleyin.

Kare başına çok az hücre. Köşe karesi başına yaklaşık 25'in altında Poisson hatası ölçümü boğar. Süspansiyonu yoğunlaştırın ya da daha çok kare sayıp bölen sayısını buna göre değiştirin.

Kare başına çok fazla hücre. Köşe karesi başına yaklaşık 100'ün üzerinde hücreler üst üste biner ve eksik sayılır. Seyreltin ve ek faktörü hesaba katın. Kayıtlar yalnızca son tripan mavisi adımını değil, seyreltme zincirinin tamamını içermelidir.

Tripan mavisi seyreltme faktörünü unutmak. Her sonucu yarıya indirir. Bir ekim yoğunluğu beklenenin tam yarısı ya da iki katı çıkıyorsa önce seyreltme faktörünü kontrol edin.

Aynı odacığı iki kez sayıp bunu tekrarlı ölçüm saymak. Aynı odacığı yeniden yükleyip saymak süspansiyonu değil, gözlerinizi sınar. Gerçek tekrar, taze karıştırılmış bir örnekten her iki odacığın da sayılması demektir.

Uzun bir sayım sırasında hücrelerin tüpte çökmesi. İkinci yüklenen alikot, birinci yüklenenden daha seyreltiktir. Her yüklemeden hemen önce karıştırın.

Operatörler arasında farklı sınır kuralı. Aynı süspansiyonu sayan kişiler arasında, genellikle yüzde birkaç düzeyinde sistematik bir fark yaratır. Kuralı yazılı hâle getirin.

Kirli veya çizik odacık. Çizgili alandaki döküntü, yorgun gözler ve bazı otomatik sistemler tarafından hücre sayılır. Etanol ve tüy bırakmayan bir kâğıtla temizleyin, asla aşındırıcı bir malzeme kullanmayın — çizgiler kazınmıştır ve kalıcı olarak zarar görebilir.

Hemositometre ayakta kalıyor; çünkü ucuzdur, 10 mikrolitre yeter, kalibrasyon gerektirmez ve operatörün örneği görmesini sağlar. Bu son nokta önemsiz değildir: kümelenme, döküntü, kontaminasyon ve beklenmedik morfoloji manuel sayım sırasında görülebilir, oysa bir cihazın verdiği sayıda görünmezler.

Zayıf yanları verim ve operatöre bağımlılıktır. Örnek başına birkaç dakika sürer; ayrıca farklı sınır kuralları ile neyin hücre sayılacağına dair farklı yargılar uygulayan operatörler, istatistiksel hatadan daha fazla ayrışır.

Otomatik görüntü tabanlı sayaçlar aynı tripan mavisi kimyasını tek kullanımlık bir lam içinde çalıştırır ve sabit bir algoritma uygular; bu, operatör yanlılığını ortadan kaldırır ve örnek başına bir dakikanın altında sürer. Yüksek hacimli rutin sayım için doğru seçimdir. Hemositometrenin kör noktalarını da devralırlar — kümeleri onlar da yanlış sayar — ve boyut ile daireselik eşikleri tipik memeli hücrelerine göre ayarlandığı için her yeni hücre tipinde manuel sayımla doğrulanmaları gerekir.

İmpedans (Coulter ilkesi) sayaçları çalışma başına binlerce parçacık sayar ve toplam parçacık sayısında çok iyi bir kesinlik verir; ancak zar bütünlüğüne göre değil boyuta göre ayırdıkları için canlılık değeri vermezler ve uygun boyuttaki döküntüyü hücre sayarlar.

Canlılık boyası ile akış sitometrisi, hücre başına çok parametreli veri verir ve apoptotik popülasyonları nekrotik olanlardan ayırabilir. Daha fazla örnek, daha fazla kurulum ve daha fazla analiz ister; mutlak derişimler için ya sayım boncukları ya da hacimsel bir cihaz gerekir. Soru, hücrelerin kaç tane olduğu değil hangi durumda olduğuysa bunu kullanın.