Hücre Kültüründe Mikoplazma Testi

Hücre kültüründe mikoplazma denince kastedilen, Mollicutes sınıfının bir üyesidir — çoğunlukla Mycoplasma orale, M. arginini, M. fermentans, M. hyorhinis ya da Acholeplasma laidlawii. Hücre kültürü kontaminasyonlarının büyük çoğunluğundan bu birkaç tür sorumludur ve hepsi, doku kültürü odasının dışında karşılaşacağınız bir şeyden çok laboratuvara özgü bir baş belasıdır.

Dört özellik mikoplazmayı diğer bütün biyolojik kontaminantlardan daha zor yakalanır kılar:

• Boyut. Mikoplazma hücreleri kabaca 0,3–0,8 µm çapındadır ve son derece pleomorfiktir. 0,2 µm ve 0,22 µm sterilizasyon sınıfı membranlardan geçecek kadar biçim değiştirirler; yani bir takviyeyi filtreden geçirerek sterilize etmek onlara karşı güvenilir bir bariyer değildir.
• Hücre duvarı yok. Mollicutes üyelerinin peptidoglikan duvarı yoktur. Hücre duvarı sentezini engelleyerek etki eden her antibiyotik — başta penisilin — tamamen etkisiz kalır. Sürekli penisilin–streptomisin ile tutulan bir kültür, mikoplazmaya karşı korunuyor değildir.
• Görünür bir imza yok. Mikoplazma mL başına 10⁷–10⁸ organizmaya ulaşır; ne besiyerini bulandırır, ne fark edebileceğiniz bir fenol kırmızısı renk kayması yaratır, ne de rutin bir invert faz kontrast mikroskopta görülebilecek partiküller oluşturur. Görülecek hiçbir şey yoktur.
• Metabolik olarak etkindirler. Bu yoğunluklarda mikoplazma; arjinini, timidini, glukozu ve diğer besinleri doğrudan besiyerinden tüketir, yani flask normal görünürken bile hücrelerinizle rekabet eder.

Yayımlanmış yaygınlık tahminleri istikrarlı biçimde rahatsız edicidir. Sürekli hücre hatlarında kontaminasyon oranı kabaca %15–35 olarak bildirilmektedir; kamuya açık RNA-seq verileri üzerinde yapılan bağımsız bir taramada ise gönderilen deney serilerinin yaklaşık %11'inde mikoplazma okumaları bulunmuştur — kontamine kültürlerin rutin olarak yayına kadar ulaştığının kanıtı.

Mikoplazma bir kültürü nadiren öldürür. Sorun tam da budur: onu öldürmek yerine değiştirir ve bu değişiklikler sessizce sonuçlarınızın içine karışır.

Belgelenmiş etkiler arasında besiyerinden arjininin ve diğer amino asitlerin tüketilmesi, nükleotit öncüllerinin tüketilmesi, çoğalma hızının ve doygunluk yoğunluğunun değişmesi, zar bileşiminin ve yüzey antijen sunumunun değişmesi, uzun süreli taşıyıcılıktan sonra kromozom anormallikleri, sitokinlere ve ilaçlara verilen yanıtın değişmesi ve konak gen ifadesinde genel kaymalar vardır. Kontamine bir hat, kendi içinde tutarlı ve tekrarlanabilir veriler üretebilir — ama bu veriler sizin biyolojinizle ilgili değildir.

Pratik sonuçlar, paraya mal olanlardır: transfeksiyon ve transdüksiyon verimleri düşer, viral titreler değişir, sitotoksisite IC₅₀ değerleri kayar, hibridomalardan elde edilen antikor verimi azalır ve sonuçlar laboratuvarlar arasında tekrarlanamaz hale gelir. Birçok dergi ve fon sağlayıcıların çoğu artık, gönderilen bir makalede kullanılan her hücre hattı için belgelenmiş bir mikoplazma durumu bekliyor.

Kaynağı bilmek, önlemeyi mümkün kılan şeydir; çünkü kaynaklar azdır ve bulunan türlerle temiz biçimde eşleşir.

• Aynı laboratuvardaki diğer kontamine kültürler. Bu, açık ara en baskın yoldur. Pipetlemeden çıkan aerosoller, ortak kullanılan besiyeri şişeleri, ortak su banyoları ve ortak inkübatörler mikoplazmayı flasktan flaska taşır. Ortak bir inkübatördeki tek bir kontamine hat, eninde sonunda komşularına da bulaştırır.
• Laboratuvar personeli. M. orale, M. salivarium ve M. fermentans insan ağız florasının doğal üyeleridir. Açık bir flaskın üzerinde konuşarak, maskesiz bir öksürükle ya da eller aracılığıyla gelirler.
• Hayvansal kaynaklı hammaddeler. M. arginini ve A. laidlawii sığır serumuyla, M. hyorhinis ise domuz kaynaklı tripsinle ilişkilendirilir. Günümüzde serum ve tripsin filtreleniyor ve test ediliyor; dolayısıyla bu yol eskisine göre çok daha seyrek — ama sıfır değil; hayvansal kaynak içermeyen reaktiflerin riski azaltmasının nedenlerinden biri de budur.
• Dışarıdan gelen hücre hatları. Doğrulanmış bir koleksiyondan değil de bir meslektaştan alınan her hat, test edilene kadar pozitif kabul edilmelidir.

Buradan çıkan örüntü basittir: gelen her şeyi karantinaya alın, hatlar arasında şişe paylaşmayın ve test edin.

Her durum için doğru olan tek bir test yoktur. Denge; duyarlılık, sonuç süresi ve kritik bir partinin serbest bırakılmasında sonuca ne kadar güvenilebileceği arasında kurulur.

PCR ve qPCR, Mollicutes üyelerinin ortak taşıdığı 16S rRNA geninin (ya da 16S–23S ara bölgesinin) korunmuş bölgelerini çoğaltır. Gerçek zamanlı testler yaklaşık 1–10 CFU/mL'ye kadar güvenilir biçimde saptar ve sonucu birkaç saat içinde verir. Çoğu laboratuvarda varsayılan rutin tarama yöntemidir. İki uyarı: PCR, canlı organizmaların yanı sıra ölü olanların DNA'sını da saptar; ayrıca koşullandırılmış besiyerindeki inhibitörlerden kaynaklanan yalancı negatifler ve amplikon bulaşmasından kaynaklanan yalancı pozitifler gerçek risklerdir. Her seferinde bir iç amplifikasyon kontrolü ve bir kalıpsız kontrol çalıştırın.

Enzimatik lüminesans testleri, ADP'yi ATP'ye dönüştüren mikoplazmaya özgü enzimlerden yararlanır; substrat eklenmeden önceki ve sonraki lüminesans okumalarının oranı sonucu yaklaşık 20 dakikada verir. En hızlı seçenektir ve termal döngüleyici gerektirmez; ancak yalnızca canlı organizmaları saptar ve PCR'den daha az duyarlıdır.

Floresan DNA boyama, Hoechst 33258 ya da DAPI ile yapılır ve mikoplazma DNA'sını sitoplazma üzerinde ve hücreler arasında küçük, çekirdek dışı benekler olarak gösterir. Doğrudan test kültürü üzerinde okunduğunda duyarsızdır — yaklaşık 10⁶ CFU/mL. Dolaylı olarak, yani test süpernatanı Vero ya da 3T6 gibi temiz bir indikatör hat üzerinde 3–6 gün birlikte kültüre edildikten sonra okunduğunda duyarlılık kabaca 10² CFU/mL'ye çıkar. Ucuzdur ve yalnızca bir floresan mikroskop gerektirir, ama iyi okumak deneyim ister.

Doğrudan kültür, mikoplazma sıvı besiyerinde ve agarda, aerobik ve anaerobik koşullarda 28 güne kadar inkübe edilerek yapılır; farmakopelerin referans yöntemi budur ve üretebildiği organizmalar için en duyarlı olanıdır. Zayıf yanı, önemli kontaminantların bazılarının — özellikle M. hyorhinis suşlarının — zor üremesi ya da hiç üreyememesidir; dolayısıyla tek başına kültür onları kaçırabilir. Bu nedenle farmakope testleri doğrudan kültürü indikatör hücreli DNA boyamayla birlikte uygular.

Dizileme temelli tarama, zaten elinizde olan RNA-seq ya da tüm genom verilerinden kendiliğinden çıkar: Mollicutes genomlarına eşlenen okumalar güçlü bir kontaminasyon kanıtıdır. Sipariş edeceğiniz bir test değildir, ama herhangi bir veri kümesi üzerinde bedava bir geriye dönük kontroldür.

Bir araştırma laboratuvarı için savunulabilir bir test takvimi:

1. Teslim alındığında, hat genel inkübatöre girmeden önce. Temiz çıkana kadar ayrı bir inkübatörde ya da en azından kendi besiyeri olan ayrı bir rafta karantinaya alın.
2. Yeni bir viyal çözüldükten sonra, o banka kendisi test edilmemişse.
3. Ayda bir, aktif kültürdeki her hat için. Hücresel tedavi ya da aşı çalışması yürüten laboratuvarlarda haftalık test yaygındır.
4. Herhangi bir ana ya da çalışma hücre bankasını dondurmadan önce. Kontamine bir hattı bankalamak, sorunu yıllara yaymak demektir.
5. Sonucunu yayımlamayı ya da bir serbest bırakma kararında kullanmayı düşündüğünüz her kritik deneyden önce.
6. Herhangi bir olaydan sonra — bir dökülme, bir inkübatör arızası, odanın başka bir yerinde şüphelenilen bir kontaminasyon.

Kültürü en duyarlı noktada test edin: hücrelerin üzerinde en az 48–72 saat kalmış besiyerinden, en az %70–80 konflüent bir flasktan ve en az iki pasaj boyunca hiç antibiyotik bulunmadan. Besiyerindeki antibiyotikler organizmayı ortadan kaldırmadan saptama sınırının altına baskılar ve gerçek bir pozitifi yalancı negatife çevirir.

Pozitifin gerçek olduğunu ve yayılmış olduğunu varsayarak hareket edin.

1. Kültürü pasajlamayı durdurun. Bir kontrol planı çerçevesinde olmadıkça kabinde bir daha açmayın.
2. İkinci ve mekanizma olarak farklı bir yöntemle doğrulayın. Dolaylı DNA boyamayla ya da enzimatik bir testle doğrulanmış bir PCR pozitifi, üzerine karar verebileceğiniz bir sonuçtur. Jeldeki tek bir PCR bandı değildir.
3. Aynı inkübatördeki diğer bütün hatları ve ortak kullanılan her reaktif şişesini test edin. Elinizde veri olana kadar yatay yayılmayı varsayın.
4. Dekontamine edin. İnkübatörü su tepsisi dâhil boşaltıp dezenfekte edin, kabini silin, söz konusu dönemde açık olan ortak besiyeri ve takviye şişelerini atın ve su banyosunun suyunu değiştirin.
5. Kayda geçirin. Hattı, pasajı, tarihi, kullanılan testi ve sonunda ne yapıldığını yazın. Kayda geçmeyen kontaminasyon geri gelir.
6. Temiz bir dondurulmuş stok varsa oradan yeniden başlayın. Bu neredeyse her zaman tedaviden daha hızlı, daha ucuz ve daha savunulabilirdir.

Varsayılan seçenek atmaktır ve bunun iyi nedenleri vardır. Tedavi yavaştır, tam olarak etkili değildir ve sonunda elinizde geçmişine bütünüyle kefil olamayacağınız bir hat kalır.

Arındırmayı denemek, yalnızca hat gerçekten yeri doldurulamaz olduğunda anlamlıdır — benzersiz bir primer izolat, üretmesi aylar almış bir klon, hiçbir yerde temiz dondurulmuş stoğu bulunmayan bir hat.

Tedaviye girişecekseniz, yayımlanmış literatürden çıkan gerçekçi tablo şudur: tek bir etken vakaların %100'ünü temizlemez; farklı mekanizmalara sahip iki etkeni birleştiren formülasyonlar (tipik olarak bir kinolon ile bir pleuromutilin ya da bir makrolid) tek etkenli her seçenekten daha iyi sonuç verir; daha başarılı protokoller için bildirilen temizlenme oranları tedavi edilen hatların %70–85'i düzeyindedir; ve kürler yaklaşık iki ila üç hafta sürer. Tedavi normalde izole edilmiş bir kültürde, ayrı bir inkübatörde ve kendine ait besiyeriyle yürütülür.

En çok atlanan adım, en çok önem taşıyan adımdır: tedaviden sonra etkeni tamamen kesin ve hattı en az iki ila üç hafta antibiyotiksiz kültüre edin, sonra iki farklı yöntemle en az iki kez yeniden test edin — ancak bundan sonra genel inkübatöre geri koyun. Baskılanmış mikoplazma, baskı kalktığında yeniden ortaya çıkar; tedavi sonrası tek bir negatifle serbest bırakılan bir hat çoğu zaman bir ay sonra yeniden pozitife döner.

Önlemek her test rejiminden ucuzdur; geri çekilmiş bir sonuçtan ise kat kat ucuzdur.

• Hücre hatlarını doğrulanmış bir koleksiyondan alın (ATCC, ECACC, DSMZ, JCRB) — bir meslektaşın dondurucusundan değil. Koleksiyon stokları test edilmiş ve kimliği doğrulanmıştır.
• Gelen her hattı karantinaya alın ve negatif çıkana kadar ayrı bir inkübatörde tutun.
• Bir şişe, bir hat. Bir flaska girmiş bir pipeti asla ortak besiyeri şişesine geri sokmayın. Takviyeleri tek kullanımlık hacimlere bölün.
• Sessiz çalışın ve yüzünüzü kabinin içinden uzak tutun. İnsan kaynaklı mikoplazmanın çoğu, operatörden aerosol yoluyla gelir.
• Rutin koruyucu antibiyotik kullanmayın. Mikoplazmaya hiçbir etkileri yoktur; üstelik size teknik bir sorunu haber verecek olan bakteriyel kontaminasyonu da gizlerler.
• Erken bankalayın ve temiz bankalayın. Düşük pasajda, test edilmiş bir ana banka; kontamine bir kültürü atmayı felaket olmaktan çıkarıp küçük bir aksaklığa dönüştüren sigortadır.