PBS ve DPBS: Fark Nedir, Hangisini Kullanmalı?

Fosfat tamponlu tuz çözeltisi, monobazik/dibazik bir fosfat çifti sayesinde fizyolojik pH'a yakın tamponlanan izotonik bir tuz çözeltisidir. İçinde glukoz, amino asit, protein ve bikarbonat bulunmaz. Bir besiyeri değil, bir işlem çözeltisidir: tek tabakaları durulamak, hücreleri seyreltmek, adımlar arasında taşımak ve serumu yıkayıp uzaklaştırmak için kullanılır — hücrelerin içinde tutulabileceği bir ortam değildir.

Fosfat çiftini inkübatör dışında kullanışlı kılan şey pKa'dır. Fosforik asidin ikinci ayrışmasının pKa'sı yaklaşık 7,2'dir; bu, hücrelerin kültüre edildiği pH'ın neredeyse tam karşılığıdır, dolayısıyla bir fosfat tamponu oda havasında pH'ı iyi tutar. Bikarbonatla tamponlanan besiyerleri ise ilgili pKa'sı yaklaşık 6,1 olan karbonik asit sistemine dayanır ve pH 7,4'ü koruyabilmek için CO2 atmosferi gerektirir. Tezgah üstü bir yıkama adımının besiyeriyle değil PBS'yle yapılmasının nedeni budur.

DPBS, Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuz çözeltisidir; Renato Dulbecco ile Marguerite Vogt'un 1954'te hayvan virüsleri için plak deneyleri geliştirirken tanımladığı formülasyondan gelir. Dolayısıyla “DPBS” belirli bir tarihsel reçeteyi adlandırır. “PBS” ise bir çözelti sınıfını adlandırır ve farklı üreticiler bu adla birbirinden hatırı sayılır ölçüde farklı ürünler satar.

Bu adları birebir taşıyan iki Gibco ürününü karşılaştırmak farkı somutlaştırır.

Gibco PBS pH 7,4; 9,0 g/L (155 mM) sodyum klorür, 144 mg/L (1,06 mM) monobazik potasyum fosfat ve 795 mg/L (2,97 mM) dibazik sodyum fosfat heptahidrat içerir. Toplam fosfat yaklaşık 4,0 mM'dir ve içinde hiç potasyum klorür yoktur.

Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Gibco DPBS ise 8,0 g/L (137,9 mM) sodyum klorür, 200 mg/L (2,67 mM) potasyum klorür, 200 mg/L (1,47 mM) monobazik potasyum fosfat ve 2160 mg/L (8,06 mM) dibazik sodyum fosfat heptahidrat içerir. Toplam fosfat yaklaşık 9,5 mM'dir.

Yani DPBS daha az sodyum klorür içerir, potasyum klorür ekler ve kabaca 2,4 kat fosfat taşır. Pratik sonucu tamponlama kapasitesidir: yaklaşık 9,5 mM fosfatla DPBS, içine hücre, asidik reaktif ya da bir miktar besiyeri eklediğinizde 4 mM'lik bir PBS'ye kıyasla pH kaymasına belirgin biçimde daha iyi direnir. Bir hücre süspansiyonunu tezgahta yirmi dakika bekletiyorsanız bu fark gerçektir.

PBS sözcüğü konusunda bir uyarı. Çoğu moleküler biyoloji laboratuvarının tozdan ya da Sambrook tarzı bir protokolden hazırladığı reçete — 8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 — toplam yaklaşık 12 mM fosfatıyla Dulbecco formülasyonuna yakındır. Bu ev yapımı “PBS”, PBS pH 7,4 etiketli ticari bir şişeden çok DPBS'ye benzer. Bileşimi ön yüzdeki üç dört harften çıkarmak yerine her zaman etiketteki formülasyonu okuyun.

Hem PBS hem DPBS, kalsiyum ve magnezyum içeren bir sürümle ve içermeyen bir sürümle satılır. Deney sonuçlarını değiştiren seçim budur ve şişede PBS mi DPBS mi yazdığından bağımsızdır.

Kalsiyum ve magnezyum içeren Gibco DPBS, aynı temele 100 mg/L kalsiyum klorür (0,90 mM Ca2+) ve 100 mg/L magnezyum klorür heksahidrat (0,49 mM Mg2+) ekler. Başka hiçbir şey değişmez.

Her iki katyon da hücre yapışmasının yapısal bileşenidir. Adherens bağlantılarında hücreleri birbirine tutan kaderinler tanımı gereği kalsiyuma bağımlıdır; hücre dışı bölgelerinin bağlanmaya izin veren sert konformasyonu alabilmesi için bağlı Ca2+ gerekir ve kalsiyum uzaklaştırıldığında yapışma işlevlerini yitirip proteazlara duyarlı hale gelirler. Hücreleri hücre dışı matrikse bağlayan integrinler ise ligand bağlama cebindeki metal iyonuna bağımlı yapışma bölgesinde iki değerlikli bir katyonu koordine eder ve o katyon olmadan ligand bağlamaz.

Ca2+ ve Mg2+ uzaklaştırıldığında iki sistem birden istikrarsızlaşır. Eklendiğinde ise ikisi de korunur. Karar bundan ibarettir.

Bu çözeltilerle yapılan en yaygın hata, tripsin eklemeden hemen önce tek tabakayı kalsiyum ve magnezyum içeren bir çözeltiyle yıkamak ve ardından hücrelerin neden on iki dakikada kalkıp tabakalar halinde geldiğini merak etmektir.

Tripsinleme öncesi yıkamanın iki görevi vardır. Açık olanı serumu uzaklaştırmaktır, çünkü serum alfa-1-antitripsin ve az sonra ekleyeceğiniz tripsini etkisizleştirecek başka proteaz inhibitörleri içerir. Daha az belirgin olanı, iki değerlikli katyonları bağlantılardan sıyırmak ve böylece enzim geldiğinde kaderin temaslarının çoktan gevşemiş olmasını sağlamaktır. Ca/Mg içeren bir yıkama birinci görevi yapar, ikincisini ise etkin biçimde geri alır.

Sonuç daha uzun bir sindirimdir. Uzun sindirim; yüzey proteomunun daha fazla proteolize uğraması, daha düşük canlılık ve hemositometre sayımını ya da akış sitometrisi veya dizileme için hazırlanan tek hücre süspansiyonunu bozan topaklanmanın artması demektir. Standart tripsin-EDTA çözeltileri zaten kalsiyum ve magnezyum içermeyen dengeli bir tuz çözeltisi içinde formüle edilir ve artık katyonları şelatlamak için tam da bu nedenle EDTA içerir; dolayısıyla Ca/Mg'li bir yıkama, disosiyasyon reaktifinizdeki EDTA'nın kendi yıkama adımınızı geri almaya harcanması anlamına gelir.

Tersi hata da gerçektir. Yapışık bir tek tabakanın yerinde kalmasını istediğiniz durumlarda — bir immünofloresan protokolü sırasında, fiksasyon öncesinde ya da uyarım adımları arasında — tekrar tekrar Ca/Mg içermeyen bir çözeltiyle yıkarsanız plakadan hücre kaybeder, benekli ve büzüşmüş bir morfoloji görürsünüz. Bu adımlar için doğru seçim kalsiyum ve magnezyum içeren sürümdür.

Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi bu tartışmanın üçüncü şişesidir ve her iki fosfat tuzlu çözeltisinden, ne zaman ona uzanılacağını belirleyen iki noktada ayrılır.

Birincisi, HBSS 1,0 g/L (5,6 mM) D-glukoz içerir. PBS ve DPBS'de ise hiçbir enerji kaynağı yoktur. Hücrelerin 37 °C'de çözelti içinde birkaç dakikadan uzun kaldığı her işlemde — doku disosiyasyonu, organ perfüzyonu, uzun bir hücre ayrıştırması, ısıtmalı tabla üzerinde görüntüleme — PBS yerine HBSS ya da EBSS kullanılmalıdır.

İkincisi, HBSS öncelikli olarak bir fosfat tamponu değildir. Toplamda yalnızca yaklaşık 0,78 mM fosfat taşır (60 mg/L monobazik potasyum fosfat artı 48 mg/L dibazik sodyum fosfat) ve bunun yerine 350 mg/L (4,17 mM) sodyum bikarbonat kullanır. Bu düşük bikarbonat düzeyi bilinçlidir: Hanks tuzları, CO2 inkübatörü olmadan, kapalı bir kapta, ortam havasında pH'ı tutacak şekilde formüle edilmiştir.

Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ise tam tersi bir tasarımdır. 2,2 g/L (26,2 mM) sodyum bikarbonat taşır ve %5 CO2 atmosferinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. EBSS'yi açık tezgaha koyarsanız CO2 uçtukça alkaliye kayar; Hanks temelli bir besiyerini %10 CO2'li bir inkübatöre koyarsanız asitleşir. Üreticilerin verdiği genel kural bikarbonatı atmosferle eşleştirmektir: ortam havası ya da %4 CO2 için yaklaşık 1,5 g/L'nin altı, %5 için 1,5-2,2 g/L, %7 için 2,2-3,4 g/L ve %10 için 3,5 g/L'nin üzeri.

HBSS ve EBSS'nin standart formları da kalsiyum ve magnezyum içerir; ikisi de tıpkı fosfat tuzlu çözeltileri gibi disosiyasyon işleri için Ca/Mg içermeyen sürümlerle satılır.

Şu işler için kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS veya DPBS kullanın: tripsin, TrypLE ya da EDTA ile disosiyasyon öncesinde tek tabakadan serumu durulamak; sayım için hücreleri seyreltmek veya yeniden süspanse etmek; liziz öncesinde pelet yıkamak; akış sitometrisi ya da tek hücre dizilemesi için tek hücre süspansiyonu hazırlamak; ve EDTA temelli disosiyasyon çözeltilerinde seyreltici olarak.

Şu işler için kalsiyum ve magnezyum içeren PBS veya DPBS kullanın: yapışık kalmasını istediğiniz yapışık hücreleri yıkamak; immünositokimya ve immünofloresan yıkama adımları; integrin ya da lektin aracılı bağlanma gibi iki değerlikli katyonların işlevsel olarak gerekli olduğu deneyler; ve yüzey yapışma yeteneğini koruması gereken hücreleri yeniden süspanse etmek.

Şu durumlarda ikisi yerine HBSS veya EBSS kullanın: hücreler 37 °C'de çözelti içinde kabaca on beş dakikadan uzun kalacaksa ya da işlem bir enerji kaynağı gerektiriyorsa — primer doku disosiyasyonu, perfüzyon, biyopsi taşınması, uzun süreli canlı hücre işlemleri. Havada yürütülen çalışmalar için Hanks tuzlarını, CO2 inkübatöründe yürütülen çalışmalar için Earle tuzlarını seçin.

Hiçbirini besiyeri olarak kullanmayın. Bu çözeltilerin hiçbirinde amino asit, vitamin veya protein yoktur. Dengeli tuz çözeltisinde tutulan hücreler tükenir ve glukoz içeren sürümlerde bile canlılık bir iki saat içinde ölçülebilir biçimde düşer.

DPBS etiketli bir şişe illa pH 7,4 değildir. Gibco'nun DPBS spesifikasyonları kalsiyum ve magnezyum içermeyen sürüm için pH 7,0-7,3, içeren sürüm için pH 7,0-7,2'dir; buna karşılık PBS pH 7,4 adıyla satılan ürün 7,4'e titre edilmiştir. Protokolünüz başlangıç pH'ına bağlıysa — pH'a duyarlı bir boya, kuantum verimi pH'a bağlı bir florofor, bir bağlanma deneyi — varsaymak yerine analiz sertifikasını kontrol edin.

Konsantreler ve tozlar genellikle Ca/Mg içermez. Kalsiyum ve magnezyum fosfatların çözünürlüğü sınırlıdır; bu yüzden 10X konsantreler, toz formatlar ve otoklavlanması amaçlanan her ürün genelde iki değerlikli katyonlar olmadan sunulur, bu katyonlar sonradan ayrı bir steril stoktan eklenir. 10X DPBS'yi seyreltip içinde kalsiyum bekliyorsanız etiketi kontrol edin.

Ca/Mg içeren bir fosfat tuzlu çözeltisini otoklavlamak çökelmeye yol açabilir. Kalsiyum içeren her fosfat tuzlu çözeltisi için 0,2 um'de steril filtrasyon daha güvenli yoldur.

Fenol kırmızısı isteğe bağlıdır ve tamponlamayla ilgisizdir. PBS ve DPBS'nin çoğu fenol kırmızısı içermeden sunulur. Fenol kırmızısı içeren sürümler esas olarak kaba pH kaymasını ya da kontaminasyonu gözle görebilmeniz için vardır; besiyerindeki fenol kırmızısıyla aynı şekilde absorbans ve floresan ölçümlerine karışırlar.

PBS-EDTA farklı bir üründür. 0,5 mM EDTA içeren bir PBS ya da DPBS, yıkama tamponu değil disosiyasyon reaktifidir. Durulama adımında düz PBS yerine kullanmayın ve başka bir işle ilgilenirken hücreleri içinde bırakmayın.