RPMI 1640 Besiyeri

RPMI 1640, Buffalo (New York) şehrindeki Roswell Park Memorial Institute'ta George Moore, Robert Gerner ve H. Addison Franklin tarafından geliştirildi ve normal insan lökositlerinin kültürüne dair bir makalede 1967 yılında yayımlandı. RPMI, enstitünün baş harfleridir; 1640 ise bir seri içindeki formülasyon numarasıdır. Besiyeri, McCoy's 5A'nın (kendisi de yer yer RPMI 1630 olarak anılır) bir modifikasyonu olarak başladı ve doğrudan, Eagle türevi besiyerlerinin zorlandığı bir soruna yönelikti: lenfoblastoid hücreleri süspansiyonda büyütmek.

Bu köken, besiyerinin hemen her ayırt edici özelliğini açıklar. Süspansiyon hücreleri tutunmayı teşvik eden yüksek kalsiyuma ihtiyaç duymaz, hatta ondan olumsuz etkilenir. Günlerce kültürde tutulan lökositler, standart bir inkübatörün CO2 düzeyinde kararlı kalan bir tamponlama sistemi ister. Ayrıca besiyerinin, redoks durumuna karşı seçici hücreleri desteklemesi gerekiyordu; klasik bazal besiyerleri arasında neredeyse benzersiz bir bileşen olan indirgenmiş glutatyonu içermesinin nedeni budur.

RPMI 1640 o günden bu yana adının çağrıştırdığından çok daha genel amaçlı olduğunu kanıtladı. Birçok yapışkan hattı sorunsuz destekler ve NCI-60 tümör paneli, hibridoma kültürü, periferik kan mononükleer hücre çalışmaları ile insan lösemi ve lenfoma hatlarının çoğu için standart tabandır.

Bütün büyük üreticilerin sunduğu biçimiyle standart RPMI 1640 formülasyonu:

İnorganik tuzlar ve ana bileşenler

Amino asitler (mg/L)

L-arginin 200; L-asparagin 50; L-aspartik asit 20; L-sistin·2HCl 65; L-glutamik asit 20; glisin 10; L-histidin 15; L-hidroksiprolin 20; L-izolösin 50; L-lösin 50; L-lizin·HCl 40; L-metiyonin 15; L-fenilalanin 15; L-prolin 20; L-serin 30; L-treonin 20; L-triptofan 5; L-tirozin disodyum tuzu dihidrat 29; L-valin 20.

Vitaminler (mg/L)

i-İnositol 35; kolin klorür 3; para-aminobenzoik asit 1; folik asit 1; niasinamid 1; tiyamin·HCl 1; D-kalsiyum pantotenat 0,25; biyotin 0,2; riboflavin 0,2; B12 vitamini (siyanokobalamin) 0,005.

Bu listede dört nokta üzerinde durmaya değer, çünkü RPMI'ı RPMI yapan şey bunlardır:

• Kalsiyum çok düşüktür. DMEM ve MEM'deki 1,8 mM'a karşılık 0,42 mM. Bu bilinçli bir tercihtir — düşük kalsiyum, süspansiyon kültürünü baltalayacak hücre–hücre ve hücre–yüzey tutunmasını caydırır.
• Fosfat çok yüksektir. Yalnızca disodyum fosfattan gelen yaklaşık 5,6 mM, DMEM'inkinin kabaca altı katıdır. Bu, RPMI'a bikarbonatın ötesinde kayda değer bir ikincil tamponlama kapasitesi kazandırır ve rutin kullanımdaki kararlılığına katkı verir.
• İndirgenmiş glutatyon bulunur, 1 mg/L düzeyinde. Başka hiçbir klasik bazal besiyeri bunu içermez. Primer lökositler için önemli olan antioksidan kapasiteye katkı sağlar.
• Biyotin, B12 vitamini, PABA ve hidroksiprolin bulunur; bunların hiçbiri DMEM veya MEM'de yer almaz. Amino asit derişimleri çok daha düşük olsa da RPMI'ın vitamin kapsaması, Eagle türevi besiyerlerinden geniştir.

Eksik olana da dikkat edin: RPMI hiç demir kaynağı ve eser element taşımaz. Bunları serum sağlar.

RPMI 1640, 2.000 mg/L D-glukoz içerir — yani 2,0 g/L ya da 11,1 mM. Bu, standart formülasyon değeridir ve tedarikçiden tedarikçiye değişmez; çünkü RPMI 1640 tescilli değil, yayımlanmış standart bir formülasyondur. Herhangi bir üreticinin veri sayfasını bir başkası için yazılmış bir protokolle karşılaştırıyorsanız, ürün adı aksini söylemedikçe glukoz hepsinde 2,0 g/L'dir.

İstisnalar, açıkça etiketlenmiş varyantlardır:

• ATCC modifikasyonlu RPMI 1640 glukozu 4.500 mg/L'ye (4,5 g/L, 25 mM) çıkarır ve 1 mM sodyum piruvat ile 10 mM HEPES ekler.
• Glukozsuz RPMI 1640 hiç glukoz taşımaz ve karbon kaynağını kendinizin belirlediği metabolik çalışmalarda kullanılır.
• HEPES'li RPMI 1640 glukozu 2,0 g/L'de tutar ve tamponu ekler.

11,1 mM ile RPMI'ın glukozu fizyolojik kan glukozuna yakındır ve yüksek glukozlu DMEM'inkinin kabaca yarısıdır. Bu, 25 mM glukozun birçok hücre tipinde oksidatif fosforilasyonu baskılayan farmakolojik bir derişim olduğu metabolizma ve immünometabolizma çalışmalarında gerçek bir üstünlüktür. Çok yoğun kültürler içinse dezavantajdır; bu kültürler glukozu daha erken tüketir ve daha sık besleme ister.

RPMI 1640'ın çalışma pH'ı 7,2 ± 0,2'dir; %5 CO2 ortamında dengelenmiş tam besiyerinde ölçülür. Bikarbonatla tamponlanan her besiyerinde olduğu gibi, tezgâhta soğukken ölçülen bir şişe daha yüksek okur, çünkü çözünmüş CO2'sini yitirmiştir; inkübatörde şartnamedeki değere döner. RPMI'ın yüksek fosfat içeriği ona DMEM'den fazla, CO2'den bağımsız tamponlama verir; bu yüzden kullanım sırasında daha yavaş kayar.

Bunlar en çok kullanılan iki bazal besiyeridir ve birbirinin yerine geçmezler. Başlıca farklar kalsiyum, fosfat, glukoz, amino asit derişimi ve bikarbonattır — bu sayfanın sonundaki karşılaştırma tablosu, her farkın pratikteki sonucuyla birlikte bileşen düzeyindeki tam görünümü verir.

Pratikte karar genellikle üç soruya iner.

Kültür süspansiyonda mı, yapışık mı? Süspansiyondaki lenfoid ve hematopoetik hücreler RPMI'a gider. Sıkı yapışan fibroblast ve epitel hatları DMEM'e gider. RPMI'ın düşük kalsiyumu güçlü tutunmaya karşı çalışır; DMEM'in 1,8 mM kalsiyumu ise onu destekler.

Hattın yayımlanmış protokolü ne diyor? Yerleşik hatlar için bu bir tercih meselesi değildir. Jurkat, K562, THP-1, Raji, U937, HL-60, MOLT-4, NCI-60 panelinin çoğu üyesi ve hibridomaların çoğu, referans protokollerinde RPMI 1640 taşır. HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero, COS-7 ve C2C12 ise DMEM taşır. Bir hattı ikisi arasında değiştirmek ikilenme süresini, doygunluk yoğunluğunu ve çoğu zaman protein ifadesini değiştirir; yeniden karakterize etmediğiniz sürece literatürle karşılaştırmayı geçersiz kılar.

Metabolik talep nedir? 25 mM glukoz ve RPMI'ın kabaca dört katı amino asit derişimiyle DMEM; yoğun, hızlı ve yüksek talepli kültürler için kurulmuştur. 11 mM glukoz ve ölçülü amino asit düzeyleriyle RPMI ise günler boyunca orta hızda büyüyen süspansiyon hücreleri için kurulmuştur. Yüksek talepli bir kültürü RPMI'da zorlamak, onu daha sık beslemek demektir.

Gerçekten işe yarayan bir melez var: glukozu 4,5 g/L'ye çıkaran, 1 mM sodyum piruvat ve 10 mM HEPES ekleyen ATCC modifikasyonlu RPMI 1640. RPMI'ın iyonik karakterini korurken yüksek glukozlu bir besiyerinin besin rezervini verir; RPMI'a bağımlı olup yüksek yoğunluğa çıkan hibridomalar ve benzeri kültürler için iyi bir seçenektir.

Yerleşik lenfoid ve hematopoetik hatlar. Jurkat, K562, HL-60, THP-1, U937, Raji, Ramos, MOLT-4, Daudi ve B ile T lenfoblastoid hatların çoğu. Standart takviye %10 FBS ve 2 mM L-glutamindir.

Primer insan lökositleri. PBMC, izole T hücreleri, B hücreleri, monositler ve dendritik hücre kültürleri. RPMI'ın özgün tasarım amacı buydu. Uzun süreli primer kültürlerde RPMI'ın glutatyon içeriği ve geniş vitamin kapsaması kayda değer üstünlüklerdir.

Hibridomalar ve antikor üretimi. Çoğu zaman ek takviyelerle kullanılan RPMI 1640, klasik hibridoma tabanıdır. Üretimde artık kimyasal olarak tanımlanmış hibridoma besiyerleri norm hâline geldi, ama füzyon ve klonlamada standart hâlâ RPMI'dır.

Birçok yapışkan tümör hattı. MCF-7, A549, PC-3, HT-29, SK-MEL ve daha pek çoğu rutin olarak RPMI'da tutulur. RPMI'ın yalnızca süspansiyon hücreleri için olduğuna dair bir kural yoktur; NCI-60 paneli, yapışkan ve süspansiyon üyeleriyle birlikte RPMI'da büyütülür.

RPMI'ın kötü bir tercih olduğu yerler: bağlantı oluşumu veya farklılaşma için yüksek kalsiyuma ihtiyaç duyan hücreler, modifiye bir formülasyon olmadan çok yüksek yoğunluklu beslemeli-kesikli süreçler ve serumsuz koşulda düşük yoğunlukta klonal büyüme — bu sonuncusu F-12 türevi ya da amaca özel tasarlanmış bir taban gerektirir.

RPMI 1640'ın 2.000 mg/L (23,8 mM) sodyum bikarbonatı, neredeyse her inkübatörün ayarlandığı %5 CO2 ortamıyla eşleştirilmiştir. Bu, RPMI'ın DMEM karşısındaki sessiz pratik üstünlüklerinden biridir; DMEM'in 3.700 mg/L bikarbonatı %10 CO2 için formüle edilmiştir ve bu nedenle %5'te alkali tarafta kalır.

RPMI'ın yüksek fosfatı ayrıca CO2'den bağımsız çalışan ikincil bir tampon sağlar; böylece besiyeri, aynı bikarbonat düzeyindeki düşük fosfatlı bir besiyerine kıyasla tezgâhta geçen süreye daha iyi dayanır. Yine de açık bırakılırsa CO2 kaybeder ve alkaliye kayar, bu yüzden şişenin açık kalma süresini kısa tutun.

HEPES'li sürümler 25 mM (ATCC modifikasyonunda 10 mM) olarak sunulur. Akış sitometrisi, canlı hücre görüntüleme, uzun süren hücre ayırma oturumları veya hücreleri birkaç dakikadan uzun süre CO2 ortamının dışında tutan her protokol için bunları kullanın. İki uyarı geçerlidir: HEPES ışık altında hidrojen peroksit üretir ve 25 mM'da bazı primer hücreler için toksiktir. Bunu bedava bir iyileştirme gibi görmeyin.

Fenol kırmızısı içermeyen RPMI; floresan ve absorbans testleri için, fenol kırmızısının fon sinyalini yükselttiği akış sitometrisi için ve hormon yanıtı çalışmaları için mevcuttur — fenol kırmızısının zayıf östrojenik etkinliği vardır ve bu, MCF-7 gibi östrojen reseptörü pozitif hatlarda belgelenmiş bir karıştırıcı etkendir.

Serum. Standart %10 FBS'dir; bazı protokoller primer veya düşük yoğunluklu kültürlerde %20, iyi adapte olmuş hatlarda %5 kullanır.

Glutamin. Glutamin içeren biçimde sunulduğunda RPMI 300 mg/L (yaklaşık 2 mM) taşır. Glutamin çözeltide amonyağa parçalandığından, glutaminsiz RPMI alıp kullanım anında taze eklemek — ya da kararlı dipeptit L-alanil-L-glutamini kullanmak — özellikle iki günde bir yerine haftada bir beslenen kültürlerde daha tutarlı sonuç verir.

2-Merkaptoetanol. Primer lenfosit, hibridoma ve fare T hücresi kültüründe standart 50 µM'dır. Sistin alımını destekler ve hücre içi glutatyonun korunmasına yardım eder. Bu, bazı primer kültürler için isteğe bağlı bir ekstra değil, gerçek bir gerekliliktir.

Sodyum piruvat ve esansiyel olmayan amino asitler. 1 mM piruvat ve 1x NEAA, özellikle NCI-60 protokollerinde ve azaltılmış serumlu kültürlerde yaygın eklemelerdir. RPMI zaten birkaç esansiyel olmayan amino asit içerir, bu yüzden NEAA takviyesi burada DMEM'e kattığından daha azını katar.

Glukozsuz RPMI, metabolik çalışmalarda kullanılır — oksidatif metabolizmayı zorlamak için galaktoz ikame etmek ya da glukozu tanımlı bir düzeye ayarlamak için. RPMI bu iş için DMEM'den daha iyi bir tabandır, çünkü başlangıç glukozu zaten fizyolojik değere daha yakındır.

Toz RPMI, ölçekte ekonomik yoldur. Sodyum bikarbonatsız sunulur; bikarbonat sulandırma sırasında eklenir (2,0 g/L), pH filtrasyon sırasındaki yükselmeyi karşılamak üzere hedefin yaklaşık 0,1–0,2 birim altına ayarlanır ve çözelti 0,22 µm'de steril filtre edilir.

Sıvı RPMI 1640, ışıktan korunarak 2–8 °C'de saklanır; açılmamış tipik raf ömrü 12–24 aydır. Glutamin eklendikten sonra yaklaşık dört haftalık bir kullanım ömrü öngörün; serumla takviye edilmiş besiyerinde iki ila dört hafta.

Işığa maruz kalma, en çok hafife alınan saklama sorunudur. Riboflavin, folik asit ve triptofan ışıkta bozunur; HEPES bulunduğunda tepkime hidrojen peroksit üretir. Laboratuvar aydınlatması altında açık bir rafta duran besiyeri, ölçülebilir biçimde ekim verimini yitirir. Şişeleri aydınlatmalı bir teşhir dolabında değil kapalı bir buzdolabında tutun ve kullanımlar arasında çalışma alikotlarını tezgâhta bırakmayın.

Yalnızca ihtiyacınız olanı ısıtın. 500 mL'lik dolu bir şişeyi tekrar tekrar 37 °C'ye getirmek glutamin hidrolizini hızlandırır ve bikarbonatı uçurur. Çoğu besleme için oda sıcaklığı yeterlidir.

Şişe açıldıktan sonra hafif pembenin magentaya doğru koyulaşması normal bikarbonat kaybıdır ve inkübatörde geri döner. Ekim yapılmamış bir şişede bulanıklık, partikül ya da sarıya kayma normal değildir — o şişeyi atın ve besiyerini değil, filtrasyonunuzu veya aseptik tekniğinizi gözden geçirin.

RPMI'ın yalnızca süspansiyon hücreleri için olduğunu sanmak. Yapışkan tümör hatlarının büyük bir kısmı rutin olarak RPMI'da tutulur.

Bir hattı proje ortasında DMEM'den RPMI'a (ya da tersine) geçirmek. Büyüme hızı, doygunluk yoğunluğu ve bazı genlerin ifadesi değişir. Geçmek zorundaysanız birkaç pasaj boyunca kademeli adapte edin ve testlerinizin temel değerlerini yeniden belirleyin.

Primer lenfosit veya hibridoma kültüründe 2-merkaptoetanolü unutmak. Yokluğu, primer T hücresi kültürlerinin beklenenin altında kalmasının sık görülen bir nedenidir.

Kalsiyuma ihtiyaç duyan hücreler için RPMI kullanmak. 0,42 mM ile RPMI, bazı epitel protokollerinin dayandığı bağlantı oluşumunu veya kalsiyuma bağlı farklılaşmayı desteklemez.

ATCC modifikasyonunu düz RPMI gibi kullanmak. Glukoz (4,5'e karşı 2,0 g/L), piruvat ve HEPES bakımından farklıdır. Hangisini kullandığınızı kayda geçirin.

Glutamin ekleyip şişeye tarih yazmamak. Glutamin bozunmasından gelen amonyak birikir ve lenfoid hücreler için, birçok yapışkan hattın tolere ettiğinden daha düşük derişimlerde toksiktir.