ACK liziz tamponu

ACK liziz tamponu kimyasal olarak basittir: suda çözünmüş üç bileşen ve fizyolojik pH'a ayarlanmış bir çözelti.

Standart 1X ACK liziz tamponu, 1 litre için

0,22 mikronluk bir membrandan süzün. Işıktan koruyarak 2-8 °C'de saklayın; oda sıcaklığında saklanmak üzere sunulan ürünler için 15-30 °C uygundur. Etiketi mutlaka okuyun, çünkü ticari ACK her iki koşulda da satılmaktadır.

Ticari formülasyonlar arasında küçük ama gerçek farklar vardır. Lonza'nın yayımladığı kullanım talimatı NH4Cl için 8.024 mg/L, KHCO3 için 1.001 mg/L ve EDTA.Na2.2H2O için 3,722 mg/L değerlerini verir; bu son değer, yayımlanmış reçetelerin çoğunda geçen 0,1 mM düzeyinin on kat altındadır. Gibco'nun ACK Lysing Buffer ürünü pH 7,0-7,7 ve 280-320 mOsmol/kg ozmolalite ile tanımlanır; amonyum klorür içeriği ise çoğu zaman 150 mM yerine 155 mM olarak belirtilir. Bu farkların hiçbiri tamponun pratikteki davranışını değiştirecek büyüklükte değildir; ancak yayımlanmış bir yöntemi birebir tekrarlıyorsanız, bütün ACK ürünlerinin aynı olduğunu varsaymak yerine o yöntemin kullandığı reçeteyi uygulayın.

EDTA, hakkında en çok soru sorulan bileşendir. Liziz yapan değil, şelatlayan bir derişimde bulunur: iki değerlikli katyonları bağlayarak katyona bağlı kümelenmeyi önler ve lökosit süspansiyonunu tek hücreli tutar. Lizizin kendisine neredeyse hiç katkısı yoktur; lizizi amonyum klorür yürütür.

"10X" sorusuna kısa bir not. ACK normalde 1X olarak sunulur ve 1X kullanılır. Bazı tedarikçiler, kullanımdan önce suyla seyreltilen 10X konsantre satar. 10X stok izotonik değildir ve hücrelere asla seyreltilmeden uygulanmamalıdır.

ACK'nın seçiciliği eritrositlerin kırılgan olmasından kaynaklanmaz. Olgun eritrositlerin çok yüksek miktarda taşıdığı, lökositlerin ise taşımadığı iki proteinin sonucudur.

Çözeltideki amonyum klorür, amonyak ve protonlarla denge hâlindedir. Yüksüz amonyak eritrosit zarından serbestçe geçer. Hücrenin içinde bir proton alarak amonyuma dönüşür; bu, hücre içi protonları tüketir ve karbonik anhidrazın katalizlediği karbon dioksit-bikarbonat dengesini kaydırır. Eritrositlerde karbonik anhidraz etkinliği çok yüksek olduğu için bu dengelenme hızlıdır.

Oluşan bikarbonat, eritrosit anyon değiştiricisi olan band 3 (AE1) aracılığıyla hücre dışı klorürle değiştirilir. Band 3 hücre başına kabaca bir milyon kopya hâlinde bulunur ve bire bir, elektriksel olarak nötr bikarbonat/klorür değişimini katalizler. Jacobs-Stewart döngüsü olarak bilinen bu halkanın net sonucu, hücrenin içinde sürekli amonyum klorür birikimidir. Ozmotik olarak bağlı su bunu izler, hücre şişer ve zar dayanamaz.

Lökositlerde bu döngüyü kayda değer bir hızda çalıştıracak ne karbonik anhidraz etkinliği ne de band 3 yoğunluğu vardır. Bir miktar amonyak alır ve hücre içi pH'ta geçici bir yükselme yaşarlar, ancak protokolün sürdüğü birkaç dakika içinde şişip patlayacak kadar hızlı çözünen madde biriktirmezler. Zamanlamanın bu kadar önemli olmasının nedeni budur: ACK içinde eritrosit ile lökosit arasındaki fark mutlak değil, kinetiktir. Hücreleri yeterince uzun bırakırsanız lökositler de zarar görür.

Mekanizmadan doğrudan iki sonuç çıkar. Birincisi, liziz buzda değil oda sıcaklığında daha hızlıdır, çünkü döngünün her basamağı sıcaklığa bağımlıdır; tamponun soğuk olması, lizizin eksik görünmesinin en sık nedenidir. İkincisi, lökositlerin yaşadığı geçici hücre içi alkalileşme biyolojik olarak nötr değildir. Kalsiyum akışı, oksidatif patlama ya da fagositoz testleri gibi sitozolik pH'a duyarlı işlevsel ölçümlerde, dansite gradyanı ile ayırma çoğu zaman amonyum klorür lizizinden daha güvenli bir seçimdir.

ACK'nın tasarlandığı standart uygulama budur. Aşağıdaki hacimler bir yetişkin fare dalağı içindir.

1. Tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Dokuyu, bir enjektör pistonu yardımıyla 70 mikronluk hücre süzgecinden geçirerek soğuk PBS ya da serumsuz besiyerinin içine ezin. Süzgeci durulayın.
2. Hücreleri çöktürün. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300-400 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı tamamen çekin; kalan süpernatan liziz tamponunu seyreltir ve tepkimeyi yavaşlatır.
3. ACK içinde süspanse edin. Dalak başına 1-3 mL 1X ACK liziz tamponu ekleyin. Lonza'nın talimatı her pelet için genel kuralı verir: peletin hacmine yakın bir hacimde ACK ekleyin. Nazikçe ve tamamen süspanse edin; kümeler düzensiz lize olur.
4. İnkübe edin. Oda sıcaklığında 1-5 dakika, hafifçe karıştırarak. Lonza'nın protokolü tüpün 30-60 saniye çalkalanmasını belirtir. Birçok laboratuvar süspansiyonu gözle izler ve mat kırmızıdan berrak, yarı saydam kırmızıya döndüğü anda işlemi durdurur; bu genellikle 1-2 dakika sürer. 5 dakikayı aşmayın.
5. Tepkimeyi seyrelterek durdurun. Tüpü hemen PBS ya da serumsuz besiyeriyle en az 10 hacme tamamlayın. ACK'yı durduran şey nötralizasyon değil, seyreltmedir.
6. Yıkayın. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Pelet artık beyaz ya da soluk pembe olmalıdır.
7. Gerekirse tekrarlayın. Pelet hâlâ gözle görülür biçimde kırmızıysa 3-6. adımları bir kez yineleyin. Dalak için ikinci tur normaldir; üçüncü tur, genellikle eksik süspansiyon ya da soğuk tampon olmak üzere daha önce bir şeylerin ters gittiğine işaret eder.
8. Süzün ve sayın. Döküntüleri ve lize hücre kümelerini uzaklaştırmak için 40-70 mikronluk süzgeçten geçirin, ardından tripan mavisiyle sayıp devam edin.

Kemik iliği aynı protokolü izler, ancak eritrosit yükü daha düşük olduğu için inkübasyon genellikle 30-90 saniyeye kısalır.

Lökosit tabakası (buffy coat) ve seyreltilmiş kan örneğe oranla daha fazla tampon ve daha uzun inkübasyon ister; genellikle paketlenmiş hücre hacminin 10-20 katı ACK ile oda sıcaklığında 5-10 dakika. Üreticiler tam kan konusunda ayrışır: Gibco, EDTA'lı tam kanı hedeflenen örnek türleri arasında sayarken, Lonza'nın kullanım talimatı ürünün tam kan lizizinde kullanılmaması gerektiğini açıkça belirtir. Elinizdeki materyalle birlikte verilen talimata uyun.

Eksik liziz - pelet kırmızı kalıyor. Nedenler sıklık sırasıyla: tamponun soğuk ya da doğrudan buzdolabından kullanılması (önce oda sıcaklığına getirin); peletin tam süspanse edilmemesi ve tamponun ulaşamadığı kümelerin kalması; eritrosit yüküne göre yetersiz tampon; tamponu seyrelten fazla artık süpernatan; süresi geçmiş ya da defalarca dondurulmuş tampon. Kalan eritrositler yalnızca görsel bir sorun değildir; sitometrenin sıvı hattını tıkar, otomatik sayımları bozar ve sonraki hazırlıklara döküntü taşır.

Aşırı liziz - canlılık düşüyor, verim azalıyor. En sık yapılan protokol hatası, hücreleri ACK içinde fazla uzun bırakmaktır. Yaklaşık beş dakikadan sonra lökositler şişip ölmeye başlar, önce granülositler etkilenir ve yüzey epitopları akış sitometrisi boyamasını etkileyecek ölçüde kaybolabilir ya da değişebilir. Taze bir dalak hazırlığında liziz sonrası canlılığınız %85-90'ın altındaysa ve doku işleme temizse, ilk bakılacak yer liziz basamağıdır.

Liziz sonrası hücreler kümeleniyor. Bunun olağan nedeni, lize hücrelerden açığa çıkan serbest DNA'dır. Yıkama basamağına DNase I eklemek ya da yıkama tamponunda EDTA bulundurmak sorunu genellikle çözer. Son yıkamanın hemen ardından 40 mikronluk süzgeçten geçirmek, hâlihazırda oluşmuş kümeleri uzaklaştırır.

Sonraki enzim tepkimeleri çalışmıyor. Liziz tamponundan taşınan EDTA kalsiyum ve magnezyumu şelatlar ve sonrasında kullanacağınız iki değerlikli katyona bağımlı her enzimi engeller; özellikle restriksiyon enzimleri, bazı tampon sistemlerindeki polimerazlar ve kollajenaz ile dispaz. Herhangi bir enzimatik basamaktan önce iki değerlikli katyon içeren bir tamponda iki kez yıkayın ve ACK ile işlenmiş hücreleri asla doğrudan dispaz ya da kollajenaz sindirimine sokmayın.

İşlevsel testler tuhaf davranıyor. Yukarıda anlatılan geçici hücre içi alkalileşme; aktivasyon durumunu, kalsiyum yönetimini ve solunum patlaması ölçümlerini değiştirebilir. İşlevsel bir ölçüm akış sitometrisi fenotipiyle uyumsuz görünüyorsa, biyolojik bir sonuca varmadan önce aynı vericiden dansite gradyanıyla ayrılmış hücrelerle karşılaştırın.

Kontaminasyon günler sonra ortaya çıkıyor. ACK, antimikrobiyal etkinliği ve koruyucusu olmayan basit bir sulu çözeltidir. Süzülmemiş sudan laboratuvarda hazırlandığında ya da ortak bir şişeden defalarca aktarıldığında, temiz bir hazırlığa kontaminasyon taşımanın kolay bir yolu hâline gelir. 0,22 mikronda süzün, alikotlara ayırın ve besiyeriyle aynı özenle davranın.

Amonyum klorür deri, göz ve solunum yolu tahriş edicidir ve yutulduğunda zararlıdır. Burada kullanılan derişimlerde çözelti hafif etkilidir, ancak katı hâli değildir ve tartım sırasında toz oluşur. Çeker ocakta ya da yerel havalandırma altında tartın, göz koruması kullanın ve tozu solumaktan kaçının.

Amonyum klorür çözeltilerini hipoklorit içeren çamaşır suyuyla karıştırmayın. Aksi hâlde zararsız olan bu reaktifin gerçekten ciddi tek tehlikesi budur. Amonyum tuzları hipokloritle tepkimeye girerek, solunduğunda toksik olan kloramin gazını oluşturur. Atık aspiratörlerini çamaşır suyuyla dekontamine eden laboratuvarların, çamaşır suyu tuzağına giden ACK atığının gerçek bir kloramin riski taşıdığını bilmesi gerekir. Amonyum klorür atığını ayrı bertaraf edin ya da hipoklorite ulaşmadan önce bol suyla seyreltin.

Güçlü bazlarla temas da aynı temel nedenle amonyak gazı açığa çıkarır.

İmmünolojide endotoksin önemlidir. ACK neredeyse yalnızca bağışıklık hücrelerinde kullanılır ve bunlar lipopolisakkarit kontaminasyonuna en duyarlı hücrelerdir. Endotoksin içeriği bilinmeyen laboratuvar deiyonize suyundan hazırlanan bir tampon, fenotipini belirlemek üzere olduğunuz hücreleri hazırlayabilir ya da etkinleştirebilir ve bu etki biyoloji gibi görünür. Endotoksin sınırı belirtilmiş, hücre kültürü kalitesinde su kullanın; işlevsel immünoloji çalışmalarında ise belgelenmiş endotoksin sınırı olan ticari bir tampon tercih edin.

Saklama ve kararlılık. Hazırlanıp süzüldükten sonra ACK, buzdolabında ve ışıktan korunarak aylarca kararlı kalır. Ticari 1X tamponun raf ömrü genellikle 12 aydır. Tekrar tekrar dondurup çözmeyin. Bulanan ya da partikül oluşturan şişeleri atın.

Eritrositlerden kurtulmanın tek yolu ACK değildir ve her zaman en iyisi de değildir.

Hipotonik (su ile) liziz aynı ozmotik ilkeye dayanır ama kabadır: kısa süreli distile su teması, ardından derişik tuz çözeltisiyle tonisitenin geri kazandırılması. Ucuzdur ve su ile 10X PBS dışında reaktif gerektirmez, ancak eritrositleri parçalamakla lökositlere zarar vermek arasındaki aralık ACK'ya göre çok daha dardır ve kullanıcılar arasında tekrarlanabilirliği zayıftır. Daha çok yedek bir yöntem olarak varlığını sürdürür.

Dansite gradyanı ile ayırma (Ficoll-Paque, Percoll, Lymphoprep) hiçbir şeyi lize etmeden eritrositleri ve granülositleri yüzme yoğunluğuna göre birlikte uzaklaştırır. Daha naziktir, lökositleri amonyuma ya da hücre içi pH kaymalarına maruz bırakmaz ve işlevsel testler için doğru seçimdir. Bedeli ise zaman, örnek başına maliyet, granülositlere ihtiyacınız varsa onların kaybı ve büyük ölçekte tekrarlanabilir biçimde uygulanması daha zor bir tekniktir.

Ticari fiksle-ve-lize reaktifleri klinik akış sitometrisinde eritrositleri lize eder ve lökositleri tek adımda fikse eder. Tam kanın immünofenotiplendirmesi için mükemmeldir; sonrasında canlı hücreye ihtiyacınız varsa işe yaramaz.

Hiç liziz yapmamak da sonraki yöntem eritrositleri tolere ediyorsa geçerli bir seçenektir; örneğin bazı manyetik boncuk izolasyonları eritrositlerden etkilenmez.

ACK'nın tasarlandığı özel iş için - kültür, sıralama ya da adoptif transfer amacıyla canlı fare splenositleri veya kemik iliği hücreleri hazırlamak - ACK standart olmayı sürdürüyor: hızlı, ucuz, yeterince nazik ve zamanlamaya uyulduğunda tekrarlanabilir.