Hücrelerin Pasajlanması (Subkültür)

Bir kültür kabı sabit bir büyüme alanı ve sabit bir besiyeri hacmi sunar. Hücreler bölündükçe glukoz ve glutamini tüketir, besiyerinin tamponlama kapasitesini bitirir, laktat ve amonyak biriktirir. Aynı anda yapışkan bir tek tabakanın boş yüzeyi de tükenir. Yüzey tümüyle kaplandığında kültür konflüenttir ve o noktadan sonra popülasyon artık dengeli üstel büyümede değildir.

Pasajlama iki kısıtı birden sıfırlar. Hücreler kaldırılır (yapışkan) ya da seyreltilir (süspansiyon) ve taze besiyeriyle daha düşük yoğunlukta yeni kaplara dağıtılır; böylece popülasyon, ikilenme süresinin sabit ve fizyolojinin tekrarlanabilir olduğu logaritmik büyüme evresine döner.

Bir kültür konflüensin ötesinde bırakılırsa üç ayrı şey ters gider:

• Büyüme durması. NIH/3T3 gibi temas inhibisyonu gösteren hatlar, tek tabaka kapandığında bölünmeyi bırakır ve temiz biçimde yeniden başlatılmaları zordur.
• Fenotipik sürüklenme. Temas inhibisyonu göstermeyen dönüşmüş hatlar çok katmanlı biçimde üst üste yığılır, tabakalar hâlinde kalkar ve kalabalığa dayanan varyantlar yönünde seçilim olabilir.
• Metabolik stres. Laktat biriktikçe ve bikarbonat tamponu aşıldıkça besiyeri sararır. Tek başına bu pH kayması bile bir sonraki pasajda canlılığı ve ekim verimini düşürür — hücreler taze besiyerinde yeniden iyi görünseler bile.

Pasaj adımı aynı zamanda rutin kültür işlerinin çoğunun yapıldığı andır: sayım, canlılık kontrolü, kriyoprezervasyon, mikoplazma örneklemesi ve deney plakalarının kurulması normalde bir pasaja bağlanır.

Konflüens, büyüme yüzeyinin hücrelerle kaplı oranıdır ve ters faz kontrast mikroskopta 4x veya 10x büyütmede gözle değerlendirilir. Bir ölçüm değil görsel bir kestirimdir; bu yüzden tutarlı bir operatör alışkanlığı gerektirir.

Sürekli yapışkan hatlar için standart hedef %70-80 konflüenstir. Bu yoğunlukta hücreler hâlâ log evresindedir, canlılık yüksektir ve bölünmeden sonra hızla toparlanırlar. Çok erken pasajlamak hücre israfına yol açar ve lag evresini uzatabilir; geç pasajlamak ise canlılığa ve tekrarlanabilirliğe mal olur.

Bir flaskın hazır olduğunu gösteren pratik ipuçları:

1. Kaplama. %70-80'de tek tabaka yüzeyin çoğunu kapatmıştır, ama koloniler arasında açık boşluklar hâlâ görünür. %100'de hiç boşluk kalmaz ve hücre sınırları kesintisiz bir mozaik oluşturur.
2. Hücre biçimi. İyi yayılmış, iyi tutunmuş, sınırları belirgin ve ışığı kıran hücreler. Yuvarlaklaşmaya, granülleşmeye ya da vakuolleşmeye başlamış hücreler zaten strestedir.
3. Besiyeri rengi. Fenol kırmızısı varken sağlıklı bir log evresi kültürü turuncu-kırmızıdadır. Beslemeler arasında sarı-turuncuya kayma genellikle kültürün bölünecek kadar yoğunlaştığı anlamına gelir. Seyrek bir flaskta pembe-mora kayma ise çoğu zaman hazır olmayı değil, kötü büyümeyi ya da kaçak yapan bir inkübatör CO2 beslemesini gösterir.
4. Yüzen döküntü. Tek tabakanın üzerinde artan sayıda yuvarlak, faz-parlak yüzen hücre, kültürün en iyi zamanını geçirdiğini gösterir.

Bazı hatların kendi kuralları vardır. NIH/3T3 konflüense ulaşmadan pasajlanmalıdır — konflüent olmasına izin vermek dönüşmüş, odak oluşturan varyantları seçer ve hattı kalıcı olarak değiştirir. MRC-5 gibi sınırlı ömürlü insan diploid fibroblast suşları genellikle %80-90'a daha yakın alınır. Primer kültürler ve kök hücreler çoğu zaman daha da dar pencerelere sahiptir; bunlar tek başına konflüensle değil farklılaşma protokolüyle belirlenir.

Süspansiyon kültürlerinde konflüens geçerli değildir. Eşdeğer tetikleyici hücre derişimidir: kültürü haftada en az iki kez sayın ve yoğunluk hattın tolere ettiği aralığın üst sınırına ulaşmadan geri seyreltin.

Aşağıdaki hacimler bir T-75 flask (75 cm2) içindir. Büyüme alanıyla kabaca ölçekleyin: T-25 için yaklaşık üçte biri, T-175 için yaklaşık 2,3 katı gerekir. Kullanmadan önce besiyerini 37 °C'ye ısıtın; Trypsin-EDTA'yı oda sıcaklığında tutun ya da kısa süre ısıtın ve uzun süre 37 °C'de bırakmayın, çünkü tripsin kendini sindirir.

1. Kültürü kontrol edin. %70-80 konflüensi ve besiyerinin berrak olduğunu, bulanıklık ya da beklenmedik pH kayması bulunmadığını doğrulayın. Flaskın üzerindeki pasaj numarasını not edin.
2. Besiyerini uzaklaştırın. Tüm tükenmiş besiyerini aspire edip atın. Tripsinizasyonun başarısız olmasının başlıca nedeni kalıntı serumdur; çünkü serum alfa-1-antitripsin ve başka proteaz inhibitörleri içerir.
3. Yıkayın. 5-10 mL Ca2+/Mg2+ içermeyen DPBS ya da PBS ekleyin, tek tabakanın üzerinde hafifçe gezdirin ve aspire edin. Kalsiyum ve magnezyum, kırmaya çalıştığınız kaderin ve integrin bağlantıları için gereklidir; bu yüzden yıkama tamponu her ikisinden de arınmış olmalıdır. Hat yüksek serumda büyütülüyorsa iki kez yıkayın.
4. Tripsinle durulayın (isteğe bağlı ama yararlı). 1-2 mL Trypsin-EDTA ekleyin, yüzeyi kaplayacak biçimde gezdirin ve hemen aspire edin. Bu, inhibitör filminin son kalıntısını da uzaklaştırır.
5. Trypsin-EDTA ekleyin. 2-3 mL %0,25 tripsin-0,53 mM EDTA (ya da hassas veya gevşek tutunan hatlar için %0,05 Trypsin-EDTA) ekleyin ve tüm yüzey kaplanacak biçimde gezdirin.
6. İnkübe edin. Flaskı 37 °C'ye geri koyun ve 2 dakika sonra, ardından her dakika mikroskopta kontrol edin. Çoğu hat 2-10 dakikada ayrılır; sıkı tutunan bazı hatlar 15 dakikaya kadar sürer. Zamanlayıcıyı kurup uzaklaşmayın — aşırı tripsinizasyon, kötü toparlanmanın en yaygın tek nedenidir.
7. Tabakayı kaldırın. Hücreler yuvarlaklaştığında ve tabaka kaymaya başladığında, flaskın yanına avuç ayanızla sert bir vuruş yaparak tabakayı yerinden oynatın. Mikroskopta tabakalar ya da ipler değil, tek tek yuvarlak hücrelerden oluşan bir süspansiyon görmelisiniz.
8. Nötralize edin. 6-8 mL serum içeren tam büyüme besiyeri ekleyin ve kalan hücreleri yıkamak ve kümeleri dağıtmak için büyüme yüzeyi üzerinde nazikçe pipetleyin. Serumsuz sistemlerde bunun yerine soya fasulyesi tripsin inhibitörü gibi tanımlı bir tripsin inhibitörü kullanın — tek başına serumsuz besiyeri tepkimeyi durdurmaz.
9. Gerekirse sayın. Tripan mavisiyle hemositometre sayımı için bir alikot alın. Her pasajda saymak iyi bir uygulamadır ve tanımlı bir ekim yoğunluğu belirtilmişse zorunludur.
10. İsteğe bağlı santrifüj. Kalıntı tripsine duyarlı hatlarda ya da besiyeri farklı bir formülasyonla değiştirilecekse 100-200 x g'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve taze besiyerinde yeniden süspanse edin. Dayanıklı hatlarda bu adımı atlayın: pelet-ve-süspanse etme döngüsü canlılığa mal olur.
11. Yeniden ekim yapın. Süspansiyonu seçtiğiniz bölme oranına ya da ekim yoğunluğuna göre yeni flasklara dağıtın, çalışma hacmine tamamlayın (T-75 için 15-20 mL) ve hattı, yeni pasaj numarasını ve tarihi etiketleyin.
12. İnkübatöre geri koyun. Flaskı önden arkaya ve yandan yana sallayın — asla daire çizerek çevirmeyin, bu hücreleri ortada toplar — ve 37 °C, %5 CO2'de düz olarak yerleştirin.

Hücreler hatta bağlı olarak 4-24 saat içinde tutunmuş ve yayılmaya başlamış olmalıdır.

Süspansiyon hatları ayırma adımına gerek duymaz; pasajlama bir seyreltmeden ibarettir.

1. Kültürü sayın ve canlılığı kontrol edin. Kararın tüm dayanağı budur, dolayısıyla atlanamaz.
2. Nazikçe yeniden süspanse edin — kabı çevirerek ya da alt üst ederek — böylece aldığınız alikot temsil edici olur.
3. Taze, önceden ısıtılmış besiyerine geri seyreltin; hattın önerilen ekim derişimine, örneğin Jurkat gibi lenfoblastoid hatlar için yaygın olarak 1 x 10^5 ile 3 x 10^5 canlı hücre/mL aralığına.
4. Alternatif olarak kısmi besiyeri değişimi. Yoğun kültürlerde hücrelerin çökmesini bekleyin ya da 100-200 x g'de 5 dakika santrifüjleyin, koşullanmış besiyerinin belirli bir bölümünü alın ve yerine taze besiyeri koyun. Bazı hatlar bir miktar koşullanmış besiyeri korunduğunda daha iyi büyür.
5. İnkübatöre geri koyun. Çalkalamalı ya da spinner kültürler doğrulanmış karıştırma hızında platforma döner; statik süspansiyon kültürleri düz olarak yerleştirilir.

İki hata biçimi birbirinin tersidir ve eşit ölçüde zararlıdır. Yoğunluğun çok yükselmesine izin vermek besiyerini tüketir ve canlılığı sert biçimde düşürür — örneğin Jurkat kültürlerinin 3 x 10^6 hücre/mL değerini aşmasına izin verilmemelidir. Çok fazla seyreltmek ise kültürü uzun bir lag evresine iter ve bazı hatlar bundan hiç tam olarak toparlanamaz; bir hat yeni canlandırılıyorsa ya da kötü büyüyorsa daha temkinli bölün.

Bölme oranı, hücrelerin ne kadar seyreltildiğini anlatır: 1:4 bölme, konflüent bir flaskın içeriğini aynı boyutta dört yeni flaska dağıtır. Hızlıdır, sayım gerektirmez ve sabit programda çalışan, iyi tanınan dayanıklı hatlar için yeterlidir.

Ekim yoğunluğu ise canlı hücre/cm2 ya da hücre/mL cinsinden, daha kesin olan yönergedir. Sayım gerektirir, ama operatörler, kap tipleri ve konflüens kestirimleri arasında tekrarlanabilirdir ve deneysel protokollerin belirttiği büyüklük budur.

İkisi, hattın konflüent yoğunluğu üzerinden birbirine bağlanır. Bir hat kabaca 1 x 10^5 hücre/cm2'de konflüense ulaşıyorsa ve 1:8 bölüyorsanız, yaklaşık 1,25 x 10^4 hücre/cm2 ekiyorsunuz demektir.

Oran seçimi, ikilenme süresine ve istediğiniz aralığa dayanır:

• İkilenme süresi 24 saat olan bir hat 72 saatte yaklaşık 3 ikilenme (8 kat) kazanır; dolayısıyla cuma günü 1:8 bölme onu pazartesi civarında konflüense döndürür.
• Aynı hat 1:4 bölündüğünde kabaca 48 saatte hazır olur.
• Yavaş büyüyen hatlar ve sınırlı ömürlü suşlar yalnızca sığ bölmelere dayanır — tipik olarak 1:2 ile 1:4 — çünkü derin bir bölme onları iyi büyüdükleri yoğunluğun altında bırakır ve sınırlı ömürlü bir suşun her pasajı sabit bir ömrün bir bölümünü harcar.

İki pratik uyarı. Birincisi, bölme oranları kap formatları arasında toplanabilir değildir: bir T-75'i dört T-25'e "1:4" bölmek, alan bakımından aslında 1:1,3'lük bir bölmedir. Her zaman büyüme alanı ya da hücre/cm2 üzerinden düşünün. İkincisi, bir hat sıvı azottan geri alınırken ilk iki üç pasaj için bölme derinliğini azaltın; çözülmüş hücrelerin ekim verimi daha düşüktür.

Pasaj numarası subkültür olaylarını sayar. Bölmenin ne kadar derin olduğuna bakmaksızın, kültür her bölündüğünde bir artar. Biyolojik yaşın ölçüsü değil, bir kayıt tutma alışkanlığıdır ve anlamı tümüyle yol boyunca kullanılan bölme oranlarına bağlıdır.

Popülasyon ikilenme düzeyi (PDL) biyolojik olarak anlamlı büyüklüktür: popülasyonun kaç kez ikilendiğinin birikimli toplamı. Her pasaj için:

PD = 3,32 x [ log10(hasat edilen hücre) - log10(ekilen hücre) ]

ve PDL bunların koşan toplamıdır. 1:2 bölme bir ikilenme ekler; 1:8 bölme üç ikilenme ekler. İkisi de "pasaj 20"de olan iki laboratuvar 40 ikilenmeden fazla farklılaşabilir.

Bunun önemi, hücre davranışının kültürde geçen süreyle değişmesinden gelir:

• Sınırlı hücre suşlarının sabit bir replikatif ömrü (Hayflick sınırı) vardır ve sonrasında geri dönüşsüz yaşlanmaya (senesans) girerler. ATCC, MRC-5'in yaşlanma başlamadan önce 42 ila 46 popülasyon ikilenmesi yapabildiğini belirtir. Suş bu sınıra yaklaştıkça ikilenme süresi uzar, hücreler büyür ve yassılaşır, doygunluk yoğunluğu düşer.
• Sürekli hücre hatları ölümsüzdür ama kararlı değildir. Karyotip, reseptör ifadesi, ilaç duyarlılığı, transfeksiyon verimi ve büyüme hızı uzun pasajlar boyunca sürüklenir. Laboratuvarlar arasında yayımlanmış tutarsızlıkların izi sıklıkla yüksek pasajlı stoklara çıkar.

Standart denetim iki katmanlı bir bankadır: özgün flakondan düşük pasajda dondurulmuş bir ana banka ve ondan çoğaltılan çalışma bankaları. Rutin kültür bir çalışma flakonundan belirli sayıda pasaj boyunca sürdürülür — yaygın olarak 15-20, hassas deneyler için 10 — sonra atılır ve taze bir flakon çözülür. Pasaj numarasını her flaska ve kültür kaydına yazın, her deney kaydına da taşıyın.

Pasajlama mantığı ikisinde de aynıdır, ama neredeyse her pratik ayrıntı farklıdır.

Yapışkan kültürler yüzey alanıyla sınırlıdır, bir ayırma adımı gerektirir, yalnızca pasajda sayılır ve kap ekleyerek ya da silindir şişelere ve çok katmanlı flasklara geçerek ölçeklenir. Zarar ayırma adımında oluşur: tripsin, reseptörler dâhil yüzey proteinlerini keser ve uzun süreli maruziyet canlılığı düşürüp yeniden tutunmayı geciktirir. İşe yarayan en yumuşak reaktifi seçmek — %0,05 Trypsin-EDTA, tek başına EDTA/Versene ya da rekombinant veya enzim içermeyen bir ayırma reaktifi — genellikle fazladan bir dakikalık inkübasyona değer.

Süspansiyon kültürleri besiyeri hacmi ve gaz değişimiyle sınırlıdır, ayırma gerektirmez, yalnızca pasajda değil düzenli olarak sayılmalıdır ve çalkalamalı flasklara, spinnerlara ve biyoreaktörlere hacimle doğrudan ölçeklenir. Onların hata biçimleri kümeleşme, yüksek karıştırmada kesme hasarı ve aşırı büyümüş bir kültürün ardından gelen yoğunluk çöküşüdür.

Bazı hatlar her iki biçimde de bulunur. HEK293 ve CHO yaygın örneklerdir: ana yapışkan hat ile süspansiyona adapte türevi birbirinin yerine kullanılamaz ve aralarındaki adaptasyon tek bir pasaj değil, haftalar süren basamaklı aktarım gerektirir.

Hücreler ayrılmıyor. Olağan neden kalıntı serumdur — Ca2+/Mg2+ içermeyen tamponla yeniden yıkayın. Diğer nedenler: tekrar tekrar ısıtma ya da donma-çözülme yüzünden etkinliğini yitirmiş tripsin, kapsamlı hücre-hücre bağlantıları olan aşırı konflüent bir tek tabaka, ya da yalnızca daha güçlü bir reaktif isteyen bir hat (%0,05 yerine %0,25, veya kısa bir EDTA ön inkübasyonu).

Hücreler ayrılıyor ama yeniden tutunmuyor. Aşırı tripsinizasyon. Belirtileri uzun bir lag, düşük tutunma verimi ve artan yüzen hücre oranıdır. İnkübasyonu kısaltın, %0,05 tripsine inin, hemen ve tümüyle nötralize edin ve enzimatik olmayan bir reaktifi düşünün.

Ayırmadan sonra kümeleşme. Genellikle parçalanmış hücrelerden salınan DNA. Nötralizasyon besiyerine düşük derişimde DNaz ekleyin ya da tripsinizasyon süresini kısaltın. Kümeler ekim tekdüzeliğini olduğu kadar hücre sayımlarını da bozar.

Düzensiz tek tabaka, hücrelerin ortada ya da kenarlarda yığılması. Flask sallanmak yerine daire çizerek çevrilmiştir ya da hücreler oturmadan önce yeri değiştirilmiştir. Önden arkaya, sonra yandan yana sallayın ve flaskı rahatsız etmeden bırakın.

Ardışık pasajlarda büyüme yavaşlıyor. Önce PDL'yi kontrol edin — sınırlı ömürlü bir suş basitçe yaşlanmaya yaklaşıyor olabilir. Değilse mikoplazmadan (gözle görülmez ve açıklanamayan yavaş büyümenin en yaygın tek nedenidir), kötü bir serum partisinden, inkübatör CO2 ya da nem sürüklenmesinden veya birikmiş aşırı tripsinizasyon hasarından şüphelenin.

Kültür konflüense çok hızlı ya da çok yavaş ulaşıyor. Bölme oranı artık ikilenme süresine uymuyordur; ikilenme süresi de hat sürükledikçe değişir. Tarihsel oranı korumak yerine yeniden sayın, ekim yoğunluğunu yeniden hesaplayın ve ayarlayın.

Kontaminasyon belirli bir pasajda ortaya çıkıyor. O oturumda açılan ortak reaktif şişelerine kadar geriye izleyin. Besiyerlerini ve takviyeleri tek kullanımlık hacimlere bölerek saklayın; böylece bir kontaminasyon olayı tüm bir bankaya yayılamaz.