Hücre Kültüründe Sığır Serumu

DMEM ya da RPMI gibi bir bazal besiyeri tuzları, glukozu, amino asitleri ve vitaminleri sağlar. Bir hücreye çoğalmasını söyleyen sinyalleri sağlamaz ve primer hücrelerin çoğu ile yerleşik hatların birçoğu için tek başına yeterli değildir. Serum bu boşluğu, birkaç bin farklı protein içeren karmaşık ve tanımsız bir karışımla doldurur.

İşlevsel olarak önemli katkıları şunlardır:

• Büyüme faktörleri ve hormonlar — insülin benzeri büyüme faktörleri, PDGF, EGF, FGF, hidrokortizon, tiroit hormonları ve diğerleri — çoğalmayı ve sağkalımı sürükler.
• Tutunma faktörleri, başlıca fibronektin ve vitronektin; tutunmaya bağımlı hücrelerin plastiğe yapışmasını ve yayılmasını sağlar.
• Taşıyıcı proteinler, özellikle albümin ve transferin. Albümin yağ asitlerini, hormonları ve eser elementleri taşır ve toksik bileşiklere karşı tamponlar; transferin ise serbest hâlde hem gerekli hem toksik olan demiri iletir.
• Lipitler — kolesterol, fosfolipitler ve yağ asitleri — birçok hücre hattının yeterli miktarda üretemediği bileşenlerdir.
• Proteaz inhibitörleri, özellikle alfa-1-antitripsin ve alfa-2-makroglobülin; pasajlamadan sonra kalan tripsini etkisizleştirir. Tripsinizasyonu durdurmak için serum içeren besiyerinin kullanılmasının nedeni budur.
• Eser elementler ve antioksidanlar, selenyum dahil.
• Fiziksel koruma, özellikle karıştırmalı ya da gaz püskürtmeli kültürde; serum proteinleri kayma gerilimini ve kabarcık hasarını azaltır.

Rutin çalışmada olağan derişim %10 (h/h)'dur; yine de yerleşik hatların çoğu %5'te iyi çoğalır ve bazı süreçler %2 ya da altında yürür. Bir hattın kaldırdığı yerde serumu azaltmak para tasarrufu sağlar, örneklerinizdeki protein zeminini düşürür ve parti değişkenliğine maruziyeti azaltır.

Serumun belirleyici özelliği tanımsız olmasıdır. Tedarikçi dahil hiç kimse belirli bir partide tam olarak ne olduğunu bilmez. Bu, hem neden bu kadar geniş bir yelpazede işe yaradığının hem de neden bu kadar çok sorun çıkardığının açıklamasıdır.

Fetal sığır serumu (FBS) ile fetal buzağı serumu (FCS) aynı üründür. İki ad birbirinin yerine kullanılır; FCS Avrupa'da, FBS ise Kuzey Amerika'da daha yaygındır. Materyalde hiçbir fark yoktur ve bunları ayrı kaliteler gibi sunan bir tedarikçi gerçek bir ayrımı tarif etmiyordur. Bu, serumla ilgili en sık sorulan sorulardan biridir ve yanıtı gerçekten bu kadar basittir.

Sığır serumları hayvanın yaşına göre ayrışır ve bu fark geri kalan her şeyi belirler:

Fetal sığır serumu, gebe bir inek gıda için kesildiğinde fetüsten toplanır. Fetüs immünolojik olarak deneyimsiz ve hızla gelişmekte olduğundan, FBS immünoglobulin ve kompleman bakımından düşük, büyüme faktörü bakımından zengindir. Güçlü çoğalma desteğiyle en az düzeyde karışan antikorun bu birleşimi, onu varsayılan seçenek yapan ve en yüksek fiyatı getiren şeydir.

Yenidoğan buzağı serumu (NBCS), yaklaşık 20 günlükten küçük buzağılardan gelir. FBS'ye göre daha yüksek toplam protein ve belirgin biçimde daha çok IgG içerir — büyük ölçüde kolostrumdan — ve daha az büyüme faktörü taşır. Gözle görülür biçimde ucuzdur ve sağlam, zor beğenmeyen hatlarda iyi çalışır.

Donör sığır serumu, özellikle kan toplamak için tutulan denetimli, kapalı bir donör sürüsündeki kabaca 12-36 aylık hayvanlardan toplanır. Denetimli sürü, mezbaha kaynaklı materyale göre daha iyi tutarlılık ve sağlık kaydı sağlar.

Erişkin sığır serumu, olgun sığırlardan gelir; en yüksek immünoglobulin içeriğine ve en düşük büyüme destekleyici etkinliğe sahiptir. En ucuz olanıdır ve yalnızca en sağlam uygulamalara uyar.

Seçim. FBS'nin zorunlu olduğunu varsaymayın. Uzun süredir kullanılan birçok hat tarihsel olarak FBS'ye alıştırılmıştır ve yenidoğan buzağı serumunda maliyetin küçük bir kısmına, üstelik zorlanan tedarik zincirine daha az yük bindirerek gayet iyi çoğalır. Doğru yaklaşım test etmektir: hattınızı birkaç pasaj boyunca FBS ile daha ucuz bir serumda paralel yürütün ve çoğalma hızını, morfolojiyi ve sizin için önemli olan işlevsel son noktayı ölçün. Ucuz serum eşdeğer başarı gösteriyorsa değişiklik bedava kazançtır. Göstermiyorsa, FBS'ye neden para ödediğinizi artık biliyorsunuzdur.

Coğrafi köken, başarım için değil düzenleyici nedenlerle önemlidir. Avustralya ve Yeni Zelanda, bulaşıcı süngerimsi ensefalopati bakımından en güçlü ülke statüsünü taşır ve serumları buna göre fiyatlanır; Amerika Birleşik Devletleri ve Güney Amerika kökenleri de yaygın olarak kullanılır. Kökenin uygulamanız için önemli olduğu yerde bu, varsayılmak yerine analiz sertifikasında belgelenmelidir.

Steril filtrasyon. Serum, bakterileri ve mikoplazmayı uzaklaştırmak için art arda gelen zarlardan, genellikle üç kez, 0,1 µm'ye kadar filtrelenir. Alışıldık 0,2 µm yerine 0,1 µm sınıfının kullanılmasının nedeni, mikoplazmanın 0,2 µm'lik bir filtreden geçebilmesidir.

Isıl inaktivasyon: 56 °C'de 30 dakika. Bu standart koşuldur ve amacı dardır — büyüme destekleyici özellikleri büyük ölçüde korurken kompleman etkinliğini yok etmek. Kompleman, antikorlarla etkinleştiğinde hücreleri parçalayabilen bir serum proteinleri şelalesidir; bu da immünolojik deneylerde önem taşır.

Isıl inaktivasyon, gerekli olduğundan çok daha geniş biçimde uygulanır; bunun büyük bölümü eski protokollerden devralınan alışkanlıktır. Komplemana duyarlı çalışmalar için gerçekten gereklidir: antikor içeren immünolojik ve sitotoksisite deneyleri, kompleman aracılı liziz çalışmaları ve bazı primer bağışıklık hücresi kültürleri. Yerleşik hatların rutin kültürü için genellikle gereksizdir ve bedelsiz de değildir — ısıtma bazı büyüme faktörlerini bozar ve ısıyla inaktive edilmiş serum düzenli olarak daha çok çökelti ve pamuksu madde üretir. Devraldığınız protokol öyle dediği için ısıl inaktivasyon yapıyorsanız, bunun hücrelerinizde herhangi bir fark yaratıp yaratmadığını sınamaya değer. Birçok laboratuvar yaratmadığını görüyor. Ayrıca ısıl inaktivasyonun bir sterilizasyon ya da virüs temizleme basamağı olmadığını unutmayın; filtrasyonun ya da ışınlamanın yerini tutmaz.

Gama ışınlama, arızi ajan riskini azaltmak için uygulanır; doğrulanmış süreçler tipik olarak 25-45 kGy aralığındadır ve yaygın sığır virüsleri ile mikoplazma için 6-8 log azalma bildirilir. Proteinlere zararı sınırlamak amacıyla dondurulmuş serum üzerinde yapılır. Işınlanmış serum, biçimsel viral güvenlik gerekliliği olan uygulamalarda standarttır ve genel olarak da giderek daha çok kullanılır. Bir miktar büyüme faktörü kaybı oluştuğundan, ışınlanmış bir parti ışınlanmamış karşılığıyla eşdeğer sayılmak yerine diğerleri gibi başarım testinden geçirilmelidir.

Çökelti normaldir. Çözülmüş serumda görünen pamuksu madde ya da ince parçacıklar hemen her zaman kriyoçökelmiş fibrin ve lipoproteindir, kontaminasyon değil. Zararsızdır; yok sayılabilir ya da çöktürülerek uzaklaştırılabilir. Bunları gidermek için serumu kendiniz filtrelemeyin, çünkü bu proteinleri sıyırır ve steril bir ürünü kontamine etme riski taşır. Isıyla inaktive edilmiş serum, işlenmemiş seruma göre daha yoğun çökelir.

Serum partiden partiye değişir. Aynı tedarikçiden, aynı kökenden ve aynı kaliteden iki parti, gözle görülür biçimde farklı çoğalma hızlarını, ekim verimlerini ve farklılaşma davranışlarını destekleyebilir. Hassas bir hücre hattı ya da uzun bir çalışma için bu değişkenlik, tekrarlanabilirliğe yönelik gerçek bir tehdittir — proje ortasında serum partisini değiştirmek, sonradan teşhis edilmesi çok zor biçimlerde sonuçları kaydırabilir.

Parti testi yordamı:

1. Örnek isteyin. Tedarikçiden güncel üç ila beş partinin 25-50 mL'lik test örneklerini, her biri için analiz sertifikasıyla birlikte isteyin.
2. Paralel test edin; kendi hücrelerinizi, kendi besiyerinizi ve kendi deneylerinizi kullanarak mevcut partinizi referans alın. Tedarikçi verisi bunun yerine geçemez, çünkü farklı hücrelerde üretilmiştir.
3. Sizin için önemli olanı ölçün. En azından: birkaç pasaj boyunca çoğalma hızı, ekim ya da klonlama verimi ve son canlı hücre yoğunluğu. Buna işinizin dayandığı işlevsel son noktayı ekleyin — farklılaşma, transfeksiyon verimi, virüs verimi, antikor titresi, morfoloji. Hızlı çoğalmayı destekleyen ama farklılaşmayı engelleyen bir parti, farklılaşma çalışan bir laboratuvar için kötü bir partidir.
4. Yeterli sayıda pasaj yürütün. Tek pasajlık testler birikimli etkileri kaçırır. Üç ila beş pasaj makul bir alt sınırdır.
5. Kazanan partiyi rezerve edin. Tedarikçiler belirli bir süre için rezerve edilmiş bir miktarı sizin adınıza tutar. Proje için, tercihen bir yıllık çalışma için yetecek kadar rezerve edin.
6. Geçişte çakıştırın. Rezerve edilen parti bittiğinde, geçip umut etmek yerine yeni partiyi eskisiyle paralel test edin.

Analiz sertifikası. Onu dosyalamak yerine gözden geçirin. İşe yarar kalemler arasında endotoksin (yaygın olarak 10 EU/mL'nin altı, düşük endotoksinli kalitelerde 1 EU/mL'nin altı belirtilir), toplama sırasındaki hemolizin göstergesi olarak hemoglobin, toplam protein, ozmolalite, pH, sterilite ve mikoplazma testi, viral testler ve menşe ülkesi yer alır.

İzlenebilirlik. International Serum Industry Association, mezbahadan son kullanıcıya kadar zinciri bağımsız üçüncü taraf denetimiyle belgelemeyi amaçlayan bir izlenebilirlik sertifikasyon programı yürütür. Bunun önemi şuradan gelir: serumun yanlış etiketlenmesi ve tağşişi — ürünün gerçekte olduğundan daha yüksek bir kalite ya da daha elverişli bir köken olarak satılması — kökenler arasındaki büyük fiyat farklarının sürüklediği, bu pazarda belgelenmiş bir sorun olmuştur. Kökeni ve zilyetlik zincirini belgeleyebilen tedarikçilerden alın ve olağandışı ucuz bir premium köken partisine kuşkuyla yaklaşın.

Saklama ve kullanım. -20 °C'de saklayın. 2-8 °C'de gece boyu, ya da oda sıcaklığında veya 37 °C'de arada yavaşça çalkalayarak çözün; serumu uzun süre 37 °C'de bırakmayın ve daha yüksek sıcaklıklarda çözmeyin. İlk çözmede tek kullanımlık hacimlere bölün, çünkü tekrarlanan donma-çözünme serumu bozar ve çökelti üretir. Riboflavini ve bazı başka bileşenleri bozduğu için uzun süreli ışıktan koruyun.

Fetal sığır serumu nereden gelir. FBS, sığır eti endüstrisinin bir yan ürünüdür. Serum için hayvan yetiştirilerek üretilmez. Gebe olduğu anlaşılan bir inek et için kesildiğinde, mezbahada rahim ve fetüs çıkarılır ve fetüsten kan toplanır; bu kan sonra pıhtılaştırılıp santrifüjlenerek, filtrelenip dondurularak seruma dönüştürülür. Menşe ülkesi, bu toplamanın nerede yapıldığını belirtir. Bu bölüm tedarik sorusunu doğrudan yanıtlıyor, çünkü araştırmacılar bunu soruyor ve sorudan kaçan bir tedarikçi sayfası işe yarar bir kaynak değildir.

Toplama yordamı. Fetal sığır serumu sığır eti endüstrisinin bir yan ürünüdür. Gebe olduğu anlaşılan bir inek kesildiğinde fetüs çıkarılır ve kan, anestezi uygulanmamış fetüsten kalp ponksiyonuyla toplanır. Buradaki temel refah sorusu, fetüsün bu işlemi deneyimleyebilecek durumda olup olmadığıdır. Bilimsel görüş yerleşmiş değildir ve konu gelişim evresine ve fetüsün anne dolaşımından ayrıldıktan sonra bilinçsiz kalıp kalmadığına bağlıdır. NC3Rs dahil kurumlar, sürecin kapsamlı biçimde düzenlenmediğine — bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin AB Direktifi 2010/63/EU fetal toplamayı açıkça kapsamıyor — ve mevcut kılavuzların uygulamada hayvanları koruduğuna dair kanıtın sınırlı olduğuna dikkat çekmiştir. Makul bilim insanları kaygının ağırlığı konusunda farklı görüşler taşıyor; ama bu uydurma bir tartışma değildir ve çözülmemiştir.

Tekrarlanabilirlik argümanı etikten bağımsızdır ve birçok laboratuvar için daha doğrudan ikna edicidir. Serum tanımsız ve değişkendir. Farklı partiler yüzlerce biyoetkin molekülü farklı derişimlerde içerir. Tarihsel kayıtlar bunun çok erken fark edildiğini gösteriyor — Puck, serumda değişen derecelerde toksik etkenlerin ortaya çıktığını, her partinin test edilmesi gerektiğini ve bazı mevsimlerde toplanan serumun yüksek oranda ıskartaya çıkarılmak zorunda kaldığını gözlemlemişti. Herhangi bir parti hücrelerin davranışını değiştirebiliyorsa, serum neredeyse her deneyin ortasında oturan ve bir yöntem bölümünde anlamlı biçimde raporlanamayan denetlenmemiş bir değişkendir. "%10 FBS" neredeyse hiçbir şey anlatmaz.

Tedarik ve fiyat. FBS arzı sığır kesim hacimlerine ve kesimdeki gebelik sıklığına bağlıdır; bunların hiçbiri yaşam bilimlerinden gelen talebe yanıt vermez. Pazar yinelenen fiyat sıçramaları ve kıtlıklar yaşamıştır. Üretime doğru ölçeklenen bir süreç için bu, yalnızca bir sıkıntı değil gerçek bir iş riskidir.

Düzenleyici yön. Düzenleyiciler ve fon sağlayanlar, biyolojik ilaç ve hücresel tedavi üretiminde hem arızi ajan riskini kaldırmak hem de süreç denetimini iyileştirmek için hayvansal kaynak içermeyen ham maddeleri giderek daha çok bekliyor. Serum üzerine kurulmuş bir araştırma süreci, kliniğe doğru ilerlerse eninde sonunda serumsuz olarak yeniden geliştirilmek zorunda kalacaktır ve bunu geç yapmak, erken yapmaktan çok daha pahalıdır.

Alternatifler, dürüstçe değerlendirilirse:

• Kimyasal olarak tanımlı ve serumsuz besiyerleri, hücre tipiniz için mevcut oldukları yerde en güçlü seçenektir. CHO, HEK293, hibridoma, böcek ve daha birçok iş atı hattın mükemmel ticari serumsuz ve hayvansal kaynak içermeyen besiyerleri vardır; biyoproses ortamlarında bunlar verim, tutarlılık ve akış aşağısı saflaştırma bakımından serum içeren besiyerini düzenli olarak geride bırakır. Bu hücreler için serum tartışması esasen kapanmıştır.
• Tanımlı takviyeler — rekombinant insan albümini, rekombinant insülin, rekombinant transferin, ITS karışımları, kimyasal olarak tanımlı lipitler — serumun anahtar işlevlerini bilinen bileşenlerden yeniden kurar. Serumsuz formülasyonların çoğu böyle inşa edilir.
• İnsan trombosit lizatı (hPL), mezenkimal stromal hücre kültüründe FBS'nin yerleşik bir alternatifidir ve çoğu zaman FBS'den daha hızlı çoğaltmayı destekler. Tam tanımlı değil, insan kaynaklıdır; yani bir değişken materyali bir başkasıyla değiştirir, ama sığır kaynaklı etik ve güvenlik sorunlarını ortadan kaldırır ve klinikte kullanılır.
• Serumu azaltmak, yeterince kullanılmayan bir ara adımdır. Birçok hat, ölçülebilir bir bedel ödemeden %5 ya da %2'yi kaldırır. Bu hemen uygulanabilir, uyarlama çalışması gerektirmez ve maliyeti ile değişkenliği bugünden azaltır.

Dürüst sınır. Serumsuz alternatifler her hücre tipi için mevcut değildir; uyarlama zaman alır ve başarısız olabilir. Bazı primer hücreler ve az tanınan bazı hatlar gerçekten hâlâ serum gerektirir; aksini iddia etmek kimseye yaramaz. Savunulabilir konum, serumun asla kullanılmaması gerektiği değil; ona ihtiyacı olmayan hücrelere varsayılan olarak uygulanmak yerine ihtiyacı olan hücreler için bilinçli bir seçim olması ve ölçekli ya da klinik çalışmaya taşınan her hattın uygulanabilir olan en erken aşamada serumdan çıkarılmasıdır.

Uyarlama, süspansiyona alıştırılmış üretim hatlarında genellikle kolaydır; yapışkan primer hücrelerde daha zordur.

Kademeli uyarlama standart ve daha az riskli yaklaşımdır. Serumu pasajlar boyunca basamak basamak azaltın — örneğin %10, %5, %2,5, %1, %0,5, %0 — ve her yeni azaltmadan önce kültürün normal ikilenme süresine ve %90'ın üzerinde canlılığa dönmesine izin verin. Sürecin birkaç hafta alacağını bekleyin. Kültür hâlâ zorlanıyorken bir sonraki basamağa geçmeyin.

Doğrudan uyarlama — doğruca serumsuz besiyerine geçmek — daha hızlıdır ve bazen işe yarar; özellikle iyi eşleşmiş ticari bir besiyerindeki sağlam süspansiyon hatlarında. Paralel olarak serum içeren bir yedek kültür yürütmeye devam edin, çünkü başarısızlığın sonucu kültürü yitirmektir.

Pratik noktalar:

• Öncesinde ve sonrasında hücre bankalayın. Uyarlama başarısız olursa diye başlangıç noktasında viyaller dondurun ve uyarlanan hat kararlı hâle gelir gelmez onu bankalayın. Başarıyla uyarlanmış bir hattı yitirmek can sıkıcı ve önlenebilir bir hatadır.
• Daha yavaş bir çoğalma evresi bekleyin. Uyarlama sırasında çoğalma hızındaki geçici düşüş normaldir; kalıcı bir düşüş basamağın fazla büyük olduğu anlamına gelir.
• Tutunma değişebilir. Serumu bırakan yapışkan hücreler fibronektin ve vitronektini de yitirir; bu nedenle çıplak plastik yerine kaplanmış bir yüzeye — rekombinant vitronektin, laminin ya da tanımlı bir tutunma matriksine — gerek duyabilirler.
• Tripsinizasyon yeniden düşünülmeli. Serum yokken tripsini etkisizleştirecek proteaz inhibitörü de yoktur; bu yüzden tanımlı bir tripsin inhibitörü ya da rekombinant bir ayırma reaktifi kullanın ve yalnızca seyreltmeye güvenmeyin.
• Kayma geriliminden korunma daha çok önem kazanır. Serumsuz süspansiyon kültürleri genellikle gaz püskürtme ve çalkalama hasarına karşı poloksamer 188 gibi bir yüzey etkin madde gerektirir. Ticari serumsuz besiyerlerinin çoğu birini içerir; varsaymadan önce denetleyin.
• Deneylerinizi yeniden doğrulayın. Serumu kaldırmak protein zeminini değiştirir, eklediğiniz her şeyin serbest ve bağlı derişimlerini değiştirir ve doz-yanıt deneyinde görünür etkinliği değiştirebilir. Serumsuz sonuçları, denetlemeden doğrudan eski serum içeren verilerle karşılaştırmayın.

Serum içeren, serumsuz, hayvansal kaynak içermeyen ve kimyasal olarak tanımlı — bu terimler birbirinin yerine geçmez. Sıklıkla gevşek biçimde kullanılırlar, oysa bir süreç tanımlanırken bu ayrımlar önemlidir:

Pratik sıralama serum içerenden serumsuza, oradan hayvansal kaynak içermeyene ve kimyasal olarak tanımlıya doğru gider; her basamak daha çok denetim verir ve genellikle daha pahalıdır. Bir besiyeri serumsuz olup yine de sığır albümini içerebilir; hayvansal kaynak içermeyen bir besiyeri de yine tanımsız bir bitkisel hidrolizat içerebilir — bir süreç tanımlanırken ikisi de yaygın karışıklık kaynağıdır. Tanımlı formülasyonların daha ayrıntılı ele alınışı için kimyasal olarak tanımlı besiyeri kaynağına bakın.