Monoklonal Antikor Üretimi için Hücre Kültürü Besiyerleri
Bir CHO fed-batch çalışmasının 14. gününde, kullanışlı bir besiyeri katalog ifadeleriyle değil, ölçülen çıktı ile değerlendirilir: 3.2-5.8 g/L IgG, %82 üzerinde hasat canlılığı ve üretim pikinden sonra 2.8 g/L altında tutulan laktat. Bu uygulama sayfası, CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S ve hibridoma füzyon hatları kullanılarak seed train, inokülasyon ve 12-16 günlük fed-batch üretim genelinde monoklonal antikor üretimi için hücre kültürü besiyerlerini kapsar.
Proses bağlamı — bunun biyoproseste nereye uyduğu
Monoklonal antikor üretim besiyerlerinin aynı proseste iki farklı işi desteklemesi gerekir: seed train boyunca hızlı çoğalma, ardından üretim kültüründe kontrollü metabolizma.
CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44 ve CHO-S süspansiyon prosesleri için olağan önerimiz, kimyasal olarak tanımlı, hayvansal bileşen içermeyen bir bazal besiyerinin 3. günden 12. güne kadar konsantre feed’lerle eşleştirilmesidir. Bazal besiyeri pH 7.21, spesifikasyon 7.00-7.40, osmolalite 312 mOsmol/kg, spesifikasyon 260-320 mOsmol/kg, LAL ile endotoksin ≤0.25 EU/mL, qPCR ile mikoplazma saptanmadı ve USP <71> sterillik geçer sonucuyla serbest bırakılır.
Hibridoma füzyon hatları farklı şekilde ele alınır. Serum-free geçişi genellikle daha yavaş tolere ederler; bu nedenle genellikle bir hibridoma serum-free besiyeri artı 2-4 mM L-glutamine eşdeğeri ile başlar, ardından serum taşınmasını iki pasaj boyunca azaltırız.
Fed-batch davranışı amino asit ve glukoz beslemesi tarafından güçlü biçimde şekillendirilir. CHO proseslerinde, 380 mOsmol/kg üzerindeki aşırı osmolalite bazı klonlarda qP’yi artırabilirken entegre canlı hücre yoğunluğunu azaltabilir; bu nedenle besiyeri seçimi yalnızca pik canlı hücre yoğunluğuna değil, klon metabolizmasına da bağlı olmalıdır [1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
mAb üretim besiyerinin yapması gerekenler (pH, osm, glukoz, glutamine, laktat toleransı)
Besiyeri, büyüme fazı yavaşladıktan sonra kültürü üretken tutmalıdır.
| Parametre | Çalışma hedefi | Neden önemlidir |
|---|---|---|
| Serbest bırakmada pH | 7.20-7.30, tipik lot 7.21 | İnokülasyon şokunu azaltır ve 6.95-7.15 aralığında CO2 kontrollü üretim pH’ını destekler |
| Osmolalite | 290-330 mOsmol/kg bazal, feed sonrası <380 mOsmol/kg | Konsantre besin iletimine olanak tanırken canlılığı korur |
| Glukoz stratejisi | İnokülasyonda 4.0-6.0 g/L, fed-batch sırasında 1.0-4.0 g/L | Açlığı sınırlar ve yüksek laktat birikimini önler |
| Glutamine eşdeğeri | 2-6 mM prosese bağlı | Amonyağı 4 mM üzerine çıkarmadan büyümeyi destekler |
| Laktat toleransı | 8. günden sonra <3.0 g/L düzeyini koruyun | Geç evre canlılığını ve hasat berraklığını iyileştirir |
Serbest bırakma testleri için standart CHO serum-free üretim lotu, CHO-K1 (ATCC CCL-61) içinde büyüme desteklemesini içerir: 96 h’de %95.8 canlılık, 2.7 × 10^6 cells/mL ve shake flask taramasında 22.4 h ikilenme süresi. Seçili takviye lotlarında, 96 h’de %96.3 canlılık ile paralel bir HEK293T (ATCC CRL-3216) permissive-cell kontrolü kullanılır.
Yayımlanmış fed-batch çalışmaları, glukoz ve amino asit feed zamanlamasının klon değişikliği olmadan antikor titresini %30’dan fazla değiştirebileceğini göstermektedir [2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
Önerilen setimiz, titre/canlılığa göre sıralanmış
Yeni bir CHO mAb programı için önce yüksek canlılık seçeneğiyle başlayın; klon zaten güçlü canlı hücre yoğunluğuna ulaşıyorsa daha yüksek qP sağlayan feed’i tarayın.
| Sıra | Önerilen besiyeri seti | En uygun kullanım | Tipik 14 günlük sonuç |
|---|---|---|---|
| 1 | CCM CHO-CD Fed-Batch Base + CHO Feed A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S | 4.6-5.8 g/L titre, %84-91 hasat canlılığı, pik VCD 15-22 × 10^6 cells/mL, qP 28-41 pg/cell/day |
| 2 | CCM CHO ADCF High-Density Medium + konsantre feed | Yüksek yoğunluklu süspansiyon seed train ve üretim | 3.8-5.2 g/L titre, %82-88 hasat canlılığı, pik VCD 18-26 × 10^6 cells/mL, qP 20-34 pg/cell/day |
| 3 | CCM CHO Serum-Free Transition Medium | Serum azaltma projeleri ve erken klon adaptasyonu | 2.1-3.6 g/L titre, %78-86 hasat canlılığı, pik VCD 8-14 × 10^6 cells/mL, qP 18-29 pg/cell/day |
| 4 | CCM Hybridoma SFM + supplement pack | Hibridoma füzyon hatları ve antikor tarama kültürleri | 80-450 mg/L antikor, hasatta %80-90 canlılık, 6 pasaj boyunca pasaj stabilitesi |
Sıralama önce fed-batch üretkenliğine, ardından hasat canlılığına dayanır. Downstream ekibiniz konak hücre proteini, DNA yükü veya filtre yüküne duyarlıysa, en yüksek titre koşulu en düşük maliyetli koşul olmayabilir.
Pilot taramamızda, bir CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1 modeli ilk sıradaki sette 5.4 g/L’ye ulaştı; 14. günde %88.6 canlılık ve 19.7 × 10^6 cells/mL pik VCD elde edildi. Aynı klon geçiş besiyerinde 3.0 g/L’ye ulaştı, ancak serum içeren stok kültürlerden daha kolay adaptasyon sağladı.
Ölçülen sayılarla vaka çalışması
Bir 2 L karıştırmalı tank çalışması, CCM CHO-CD Fed-Batch Base içinde 0.45 × 10^6 cells/mL’de inoküle edilen bir CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1 üreticisi ile yürütüldü. Kültürde 37 °C büyüme fazı, 5. günde 33 °C’ye sıcaklık kaydırma, %40 çözünmüş oksijen ve 3, 5, 7, 9 ve 11. günlerde feed eklemeleri kullanıldı.
| Gün | VCD | Canlılık | Glukoz | Laktat | IgG titresi |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 cells/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 cells/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 cells/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 cells/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
7. günden 14. güne hesaplanan qP 36 pg/cell/day idi. Hasat osmolalitesi 356 mOsmol/kg ve berraklaştırma öncesi son pH 7.04 idi.
Satın alma kalifikasyonu için tercih ettiğimiz profil budur: glukoz çöküşü yok, çalışma ortasından sonra laktat tüketimi ve hasatta %85 üzerinde canlılık. Benzer laktat kayması davranışı, CHO mAb kültürlerinde iyileşmiş fed-batch üretkenliği ile ilişkilendirilmiştir [3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
Satın alma notları
Erken tarama için bazal besiyerinin 500 mL veya 1 L şişelerini ve eşleşen feed konsantrelerini talep edin. Proses doğrulaması için çoğu alıcı, lota özgü analiz sertifikası ile 10 L, 20 L veya 50 L paketlere geçer.
- Önerilen başlangıç siparişi: 2 × 1 L CCM CHO-CD Fed-Batch Base, 1 × 250 mL CHO Feed A, 1 × 250 mL CHO Feed B ve 1 × 100 mL üretkenlik takviyesi.
- Serbest bırakma paketi: pH, osmolalite, endotoksin, sterillik, mikoplazma qPCR, görünüm ve büyüme destekleme.
- Küçük rozet: ÜCRETSİZ DÜNYA ÇAPINDA KARGO
- Soğuk zincir önerisi: sıvı bazal besiyeri için 2-8 °C, ışıktan koruyun, dondurmayın.
Kampanyanız 100 L’den fazla bazal besiyeri kullanıyorsa veya klon seçimi hâlâ aktifse lot rezervasyonu isteyin. Paket boyutuna ve üretim programına bağlı olarak eşleşmiş bazal ve feed lotlarını 60-120 gün boyunca rezerve edebiliriz.
Tipik tedarik süresi stoklu araştırma paketleri için 3-7 iş günü, yapılandırılmış bulk paketler için 2-5 haftadır. Bulk serbest bırakma, dolumdan önce talep edildiğinde CHO-K1 (ATCC CCL-61) içinde ek 14 günlük hücre büyümesi destekleme okumasını içerebilir.
Referanslar
[1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
[2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
[3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] Kim JY et al. MAbs 2012;4(4):466-479. doi:10.4161/mabs.20432.
