HBSS (Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi)

HBSS bir büyüme besiyeri değil, dengeli bir tuz çözeltisidir. Hücrenin ozmotik dengesini ve zar potansiyelini koruması için gereken inorganik iyonları, ayrıca anlık enerji kaynağı olarak glukozu sağlar; ancak amino asit, vitamin ve protein içermez. Hücreler içinde saatlerce hayatta kalır, ama çoğalmaz.

Formülasyonun kökeni, tuz karışımını 1940'larda geliştiren John Hanks'e dayanır; en sık atıf yapılan çalışma, dokuların soğutularak korunması üzerine Hanks ve Wallace, 1949'dur. Tasarım amacı bileşimden okunabiliyor: Hanks tuzları, dokunun sıradan atmosfer koşullarında taşınması ve işlenmesi için düşünülmüştür; bu yüzden bikarbonat düşüktür ve tamponlamanın büyük kısmını fosfat üstlenir.

Günlük kullanım alanları şunlardır:

• Tripsinleme, fiksasyon veya lizis öncesinde serumu ve besiyeri kalıntısını uzaklaştırmak için hücrelerin ve tek tabakaların yıkanması
• Boyama veya deney basamakları arasında durulama
• Doku ve primer izolatların taşınması ve kısa süreli bekletilmesi
• Enzimlerin, reaktiflerin ve hücre süspansiyonlarının seyreltilmesi
• Tam besiyeri değil de glukoz istendiği kısa süreli işlevsel çalışmalarda deney tamponu olarak kullanılması

HBSS bilinçli olarak sadedir ve işe yaramasının nedeni de bu sadeliktir: içindeki hiçbir bileşen, sonraki bir enzimatik basamağa ya da bir protein tayinine karışmaz.

Standart Hanks dengeli tuz çözeltisi formülasyonu, sunulan iki formda:

İki form bunun dışında birebir aynıdır — yalnızca üç iki değerlikli katyon tuzu çıkarılır. Ca/Mg içeren formda toplam magnezyum yaklaşık 0,9 mM'dir ve sülfat ile klorür tuzları arasında paylaşılır; kalsiyum 1,26 mM'dir. Bunlar standart formülasyon değerleridir ve tedarikçiden tedarikçiye değişmez, çünkü Hanks tuzları tescilli bir formülasyon değil, yayımlanmış bir standarttır.

HBSS'in davranışını iki özellik belirler.

Bikarbonat çok düşüktür — RPMI 1640'taki 2.000 mg/L ve DMEM'deki 3.700 mg/L'ye karşılık 350 mg/L. Hanks tuzları atmosferik CO2 için formüle edilmiştir. HBSS'teki pH kararlılığının çoğu, CO2'den bağımsız tamponlama yapan fosfat çiftinden (KH2PO4 ve Na2HPO4) gelir.

PBS ve DPBS'ten farklı olarak 5,55 mM glukoz içerir. Bu gerçek bir işlevsel farktır: HBSS içinde bekletilen hücrelerin bir enerji kaynağı vardır ve bu, uzun disosiyasyonlarda, doku taşımada ve işlevsel deneylerde önem taşır. Aynı zamanda kontamine olursa HBSS'in bakteri üremesini destekleyeceği anlamına gelir; bu nedenle ona besiyerine gösterdiğiniz aseptik özenin aynısını gösterin.

Toplam ozmolalite fizyolojik değere yakındır, 280-300 mOsm/kg civarındadır; çalışma pH'ı ise yaklaşık 7,0-7,4'tür.

En sık yanlış yapılan seçim budur; oysa mantığı bir kez söylendiğinde açıktır.

İki değerlikli katyonlar hücre yapışması için gereklidir. Kalsiyum, kaderin aracılı hücre-hücre bağlantıları için şarttır; integrin aracılı yüzeye tutunma için ise kalsiyum ve magnezyum birlikte gerekir. Bunları uzaklaştırın, yapışma zayıflar.

Hücrelerin kalkmasını istediğinizde kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS kullanın. Tripsin ya da başka bir disosiyasyon reaktifi uygulamadan hemen önce yapacağınız yıkama budur. Tek tabakayı Ca/Mg içermeyen HBSS ile durulamak hem serumu — dolayısıyla tripsini köreltecek proteaz inhibitörlerini — uzaklaştırır hem de bağlantıları gevşetmeye başlar; böylece ardından gelen disosiyasyon daha hızlı ve daha yumuşak olur. Ca/Mg içermeyen HBSS aynı zamanda EDTA temelli disosiyasyon reaktifleri için doğru seyrelticidir, çünkü tampondaki kalsiyum EDTA'yı şelatlayıp tüketirdi.

Hücrelerin yapışık ve işlevsel kalmasını istediğinizde kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS kullanın. Kullanmayı sürdüreceğiniz bir tek tabakayı yıkarken, primer bir izolatı bekletirken, doku taşırken ve sinyal iletiminin önemli olduğu her işlevsel deneyde — kalsiyum bir ikincil habercidir ve kalsiyumsuz bir tampon görüntüleme, salgı ve aktivasyon deneylerindeki yanıtları çarpıtır. Kollajenaz dahil birçok enzim de iki değerlikli katyon gerektirir; bu yüzden kollajenaz sindirimlerinde Ca/Mg içeren form kullanılmalıdır.

Kullanışlı bir pratik kural: sonraki basamakta bir enzim ya da canlı bir işlev ölçümü varsa Ca/Mg içereni kullanın. Sonraki basamak hücreleri kaldırmaksa Ca/Mg içermeyeni kullanın.

Bu üçü pratikte neredeyse birbirinin yerine kullanılır ve çoğu zaman bunda bir sakınca yoktur — ama her zaman değil. Bu sayfadaki karşılaştırma tablosu bileşen düzeyindeki görünümü veriyor; pratik ayrımlar ise şunlar.

Glukoz. HBSS'te vardır (5,55 mM), PBS ve DPBS'te yoktur. Hücreler birkaç dakikadan uzun bekletilecekse ya da disosiye ediliyor, taşınıyor veya işlevsel olarak ölçülüyorsa, HBSS'in glukozu gerçek bir avantajdır. Lizis öncesi 30 saniyelik bir durulamada ise hiçbir fark yaratmaz.

Tamponlama. DPBS, üçü arasında en güçlü basit tampondur — fosfatı toplamda 8 mM civarındadır, yani HBSS'in yaklaşık 0,8 mM'sinin birkaç katıdır — ve CO2 olmadan, açık tezgâhta pH'ı iyi tutar. HBSS ise daha zayıf bir fosfat tamponuna ve küçük bir bikarbonat katkısına dayanır. %5 CO2'li bir inkübatörde HBSS'in bikarbonatı pH'ı tutmaya yetecek düzeyin çok altında kalır; bu nedenle HBSS uzun süreli inkübatör kullanımına uygun değildir.

İki değerlikli katyonlar. Üçü de kalsiyum ve magnezyum içeren ve içermeyen formlarda sunulur ve aynı seçim mantığı üçü için de geçerlidir.

İyonik ayrıntı. HBSS, bir besiyerinin iyonik profiline daha yakındır — magnezyumu hem sülfat hem klorür olarak taşır ve fosfat yükü daha düşüktür. DPBS ise ağır fosfat tamponlu bir salin çözeltisidir. Bu ağır fosfat tek bir özel durumda dezavantajdır: fosfat kalsiyumu çöktürür, dolayısıyla kalsiyumlu DPBS uzun saklamada veya otoklavlamadan sonra çözünmeyen kalsiyum fosfat oluşturabilir; ayrıca fosfat, fosfata duyarlı bazı deneylere ve mineralizasyon çalışmalarına karışır.

Hızlı seçim: lizis veya fiksasyon öncesi durulama için üçü de olur. Tripsinleme öncesinde Ca/Mg içermeyen form — üçünden herhangi biri, ama alışılmış olan HBSS ya da DPBS'tir. Doku taşıma veya uzun disosiyasyon için, glukozu nedeniyle Ca/Mg içeren HBSS. CO2'siz uzun tezgâh basamaklarında ve beslenecek hücre yoksa, daha güçlü tamponu için DPBS. Mineralizasyon veya fosfata duyarlı deneylerde ise DPBS yerine HBSS.

1X HBSS pH 7,0-7,4 aralığında kullanılır. Kullanıma hazır 1X çözelti için üreticilerin serbest bırakma spesifikasyonları genellikle 7,0-7,2 civarına ayarlanır, bazı ürünlerde daha geniş bir tolerans bulunur; yıkama ve kısa süreli bekletme için çözelti 7,0-7,4 bandının her yerinde işlevsel olarak doğrudur.

10X HBSS konsantresi bilinçli olarak asidiktir, genellikle pH 5,8-6,1 civarında. Bu bir kusur değildir ve şişede düzeltilmesi gerekmez. On kat derişimde kalsiyum, magnezyum, fosfat ve bikarbonat tuzları nötr pH'ta çökerdi; bu yüzden konsantre, tuzları çözünmüş tutmak için asidik tutulur. 1X'e seyreltildiğinde pH normal aralığa çıkar. Bir 10X stoğu ölçüp pH 6 bulduysanız ve bozulup bozulmadığını merak ediyorsanız — bozulmamıştır.

HBSS esas olarak fosfat çifti tarafından tamponlanır; 4,17 mM bikarbonatın katkısı küçüktür. Fosfat pH 7,2 civarında iyi tamponlar ve CO2'den bağımsızdır; tezgâh üstü bir işlem çözeltisinin ihtiyacı da tam olarak budur.

Bunun sonucu şudur: HBSS bir inkübatör çözeltisi değildir. %5 CO2'li atmosferde çözünen CO2 çözeltiyi asitleştirir ve 4 mM bikarbonat buna karşı koyamaz. CO2'li inkübatörde HBSS içinde bırakılan hücreler düşen bir pH'ta kalır — bu, apaçık bir başarısızlık yerine yavaş ve açıklanamayan canlılık kaybı üreten hatalardan biridir.

Tersine, atmosferik CO2 altında bekletilen HBSS, küçük bikarbonat içeriğini yavaşça CO2 olarak kaybeder ve alkaliye kayar. Pratikte bu önemsizdir ve HBSS'in normalde kullanıldığı süreler içinde fark yaratmaz.

İnkübatör dışında uzun bir işlem boyunca pH'ı güvenilir biçimde tutan bir çözeltiye ihtiyacınız varsa, olağan yanıt 10-25 mM HEPES ile tamponlanmış HBSS'tir. HEPES, CO2 olmadan pH 7,2-7,4'te iyi tamponlar. Ödünleşimler her zamanki gibidir: HEPES ışık altında hidrojen peroksit üretir ve 25 mM derişimde bazı primer hücreler için sitotoksiktir.

Saklama. HBSS 2-8 °C'de, bazı formülasyonlarda ise oda sıcaklığında kararlıdır — tedarikçinin etiketine uyun. Açılmamış raf ömrü genellikle 12-24 aydır. Glukoz içerdiği için, kontamine olursa mikrobiyal üremeyi destekler; aseptik çalışın ve kullanılmış çözeltiyi stok şişesine geri boşaltmayın.

Sıcaklık. Yapışkan (adherent) hücreleri yıkarken HBSS'i oda sıcaklığında veya 37 °C'de kullanın. Ilık bir tek tabakaya buz gibi tampon dökmek soğuk şokuna yol açar, hücrelerin kalkmasını ya da zar hasarını tetikleyebilir. Soğuk HBSS, metabolizmayı bilerek yavaşlatmak istediğinizde uygundur — doku taşıma, bazı primer izolasyonlar — ama bu bir karardır, varsayılan değil.

HBSS'i besiyeri olarak kullanmayın. İçinde amino asit, vitamin, lipit ya da protein yoktur. Hücreler birkaç saati tolere eder; HBSS içinde bir gece, kültür değil canlılık deneyidir.

Sık yapılan hatalar:

• Tripsinleme öncesi durulamada Ca/Mg içeren HBSS kullanmak. İki değerlikli katyonlar yapışmayı sürdürür; disosiyasyon uzar, daha çok enzim gerektirir ve hasar artar.
• Kollajenaz seyrelticisi olarak Ca/Mg içermeyen HBSS kullanmak. Kollajenaz kalsiyum gerektirir; sindirim beklenenin altında kalır.
• EDTA'lı disosiyasyon reaktiflerini Ca/Mg içeren tamponda seyreltmek. Kalsiyum şelatlayıcıyı tüketir.
• Hücreleri CO2'li inkübatörde HBSS içinde bırakmak. Bikarbonatı %5 CO2'de tamponlayamaz ve pH düşer.
• HBSS ile PBS'i işlevsel deneylerde eşdeğer saymak. Hücreler yalnızca durulanmak yerine ölçülüyorsa, glukoz ve farklı iyonik denge önem kazanır.
• Mineralizasyon çalışmalarında DPBS kullanmak. Yüksek fosfatı kalsiyum fosfat birikimini bozar; HBSS daha iyi seçimdir.