Memeli Hücre Seçimi için Puromisin

Puromisin, Streptomyces alboniger'in doğal bir ürünüdür. Genellikle dihidroklorür tuzu olarak sunulur (CAS 58-58-2, molekül ağırlığı 544,43; serbest baz 471,51); suda kolayca çözünen, soluk sarıdan beyaza değişen bir tozdur.

Mekanizması alışılmadık ölçüde nettir; seçici antibiyotik olarak bu kadar sevilmesinin nedeni de budur. Puromisin, tirozil-tRNA'nın 3' ucundaki aminoaçil-adenozinin yapısal bir analoğudur. Yüklü bir tRNA'nın iş gören ucuna benzediği için ribozomun A bölgesine bağlanır ve peptidil transferaz merkezi, uzayan peptit zincirini onun üzerine aktarır. Benzerlik tam o noktada biter: gerçek bir tRNA'da amino asit, hidroliz edilip devredilebilen bir ester bağıyla bağlıdır; puromisinde ise hidroliz edilemeyen bir amit bağıyla bağlıdır. Artık peptit, bir sonraki uzama turuna giremeyecek bir moleküle kovalent olarak yapışmıştır ve ribozomdan kısalmış, puromisillenmiş bir parça olarak salınır.

Bundan üç sonuç çıkar ve her biri pratikte önem taşır:

• Hem prokaryot hem ökaryot ribozomlarında etkilidir, dolayısıyla memeli hücrelerinde düşük derişimlerde iş görür.
• Hızlıdır. Protein sentezi, hasarın yavaş birikmesini beklemeden anında bozulur. Dirençli olmayan hücreler 24-48 saat içinde ölmeye başlar ve seçim genellikle 2-5 gün içinde tamamlanır — G418 veya Zeocin'den çok daha hızlı.
• Düşük derişimlerde kullanılır, tipik olarak 1-2 µg/mL; bu, G418'in kabaca iki büyüklük mertebesi altındadır. Kültüre daha az ozmotik ve kimyasal yük, seçime ise daha düşük maliyet demektir.

Seçim çalışmalarının dışında aynı kimya, yeni sentezlenen polipeptitleri işaretlemeye yarayan puromisillenme temelli yöntemlerde kullanılır; kısa bir puromisin darbesi, o sırada translasyon yapan ribozomları etiketler.

Direnç, puromisin N-asetiltransferazı (PAC) kodlayan pac geniyle sağlanır; bu gen de Streptomyces alboniger kaynaklıdır. PAC, asetil-CoA'dan bir asetil grubunu puromisinin serbest tirozinil amino grubuna aktarır. Asetillenmiş ürün artık peptidil transferaz merkezince kabul edilemez, yani biyolojik olarak etkisizdir.

Bundan birkaç pratik sonuç çıkar:

• Direnç enzimatik ve hücre içidir; bir pompa ya da hedef mutasyonu değildir. Hücrenin, ilaç geldiği hızdan daha hızlı detoksifiye edecek kadar PAC eksprese etmesi gerekir. Bu da seçim sıkılığını derişimle makul ölçüde ayarlanabilir kılar — puromisin derişimini yükseltmek gerçekten de direnç kasetini daha yüksek eksprese eden hücreleri, dolayısıyla ona bağlı transgeni daha yüksek eksprese edenleri seçer.
• Gen küçüktür, yaklaşık 600 bp; paketleme kapasitesinin dar olduğu lentiviral ve AAV vektörlerinde bu gerçek bir avantajdır. Lentiviral shRNA ve CRISPR kütüphane çalışmalarında puromisin seçiminin baskın olmasının başlıca nedeni budur.
• Detoksifikasyon yereldir. PAC eksprese eden hücreler ilacı tükettiği için, dirençli hücrelerin yoğun kültürleri komşu dirençsiz hücreleri kısmen koruyabilir. Aşağıda ele alınan, en sık görülen seçim başarısızlığının arkasındaki mekanizma budur.
• Literatürde belirteç birkaç farklı biçimde yazılır — pac, puroR, PuroR — hepsi aynı asetiltransferazı anlatır.

Puromisin direnci dominanttır ve bazı metabolik seçim sistemlerinin aksine özel bir konak genotipi gerektirmez (örneğin glutamin sentetaz veya DHFR seçimi, konağın ilgili yolakta eksik olmasına bağlıdır).

Memeli hücreler için önerilen çalışma aralığı 0,5-10 µg/mL'dir ve hücre hatlarının çoğu 1 ile 5 µg/mL arasına düşer. Evrensel bir sayı yoktur; bir makalede ya da katalogda bir hücre hattı için verilen derişim, doğrudan benimsenecek bir değer değil, kendi öldürme eğrinizin başlangıç noktası sayılmalıdır.

Yaygın başlangıç noktaları. HEK293 ve türevleri, HeLa ve NIH/3T3 dahil birçok yapışkan (adherent) hat 1-2 µg/mL civarında iyi seçilir. Birçok CHO hattı benzer bir aralıktadır; serumsuz besiyerinde süspansiyona uyarlanmış hatlarda sıklıkla 5-10 µg/mL. Primer hücreler ve bazı kök hücre hatları belirgin biçimde daha duyarlıdır ve 0,2-1 µg/mL'de seçilebilir. Bazı hatlar — belirli fare hatları ve yüksek endojen ilaç atım etkinliği olan hücreler — 10 µg/mL veya daha fazlasını ister. Bunların hepsini öldürme eğrisiyle doğrulayın.

Hücre hattına göre tipik başlangıç derişimleri. Aşağıdaki her değer bir öldürme eğrisi başlangıç noktasıdır, doğrudan benimsenecek bir derişim değil. Aynı adı taşıyan hat için bildirilen en uygun değerler laboratuvardan laboratuvara değişir; çünkü yoğunluk, serum içeriği, besiyeri ve puromisin partisi sonucu kaydırır.

Hücre hattı veya tipi	Tipik başlangıç aralığı	Notlar
HEK293, HEK293T	1-2 µg/mL	Duyarlı; seçim çoğu kez 2-3 günde tamamlanır
HeLa	1-2 µg/mL	Uysal, hızlı seçim
A549, MCF-7 ve birçok insan epitel hattı	1-3 µg/mL
NIH/3T3 ve birçok fare fibroblast hattı	2-10 µg/mL	Fare hatları genelde insan hatlarından fazlasını ister
CHO, yapışkan ve süspansiyon	5-10 µg/mL	Serumsuz süspansiyon çoğu kez aralığın alt ucunda seçilir
Jurkat ve diğer süspansiyon lenfoid hatlar	0,5-2 µg/mL	Sıklıkla en duyarlılar arasında
Primer hücreler	0,2-1 µg/mL	Yavaş büyüme öldürmeyi zayıflatır; dozu değil süreyi uzatın
hESC ve iPSC	0,2-1 µg/mL	Duyarlı; aralığın en altından başlayın
Yüksek çoklu ilaç atım etkinliği olan hatlar	10 µg/mL ve üzeri	Puromisin aktif olarak dışarı atılabilir; başka bir ajan düşünün

Bu tablodaki ya da herhangi bir yayındaki bir değeri, test edeceğiniz doz serisinin merkezi olarak alın — cevabın kendisi olarak değil.

Etkin derişimi kaydıran etkenler:

• Hücre yoğunluğu. Tek başına en büyük değişken ve en sık gözden kaçanı. Yoğun bir kültürde ilaç hücre başına tüketilip seyreldiği için aynı nominal derişim çok daha az etkilidir. Öldürme eğrinizi, seçim için gerçekten kullanacağınız yoğunlukta çalıştırın.
• Serum içeriği. Serum proteinleri puromisini bir ölçüde bağlar; bu yüzden %10 FBS içindeki bir kültür, aynı hücrelerin serumsuz veya azaltılmış serumlu besiyerindeki hâline göre genelde daha fazla ilaç ister. Bir seçimi serumlu ortamdan serumsuz ortama taşımak genellikle derişimin aşağı doğru yeniden optimize edilmesini gerektirir.
• İkilenme süresi. Puromisin, translasyon yapan hücreleri öldürür. Yavaş büyüyen, konflüent ya da dinlenme hâlindeki kültürler daha yavaş ve daha eksik ölür; seçime yarı konflüent, aktif bölünen bir kültürle başlanmasının nedeni budur.
• Puromisin partisi. Etkinlik partiden partiye değişir ve saklandıkça azalır. Yeni bir parti açtığınızda kısaltılmış bir öldürme eğrisini yeniden çalıştırın.
• Besiyeri pH'ı. Puromisin alkali pH'ta daha az kararlıdır. CO2 kontrolü kötü olduğu için alkaliye kaymış bir kültür, seçilim baskısını beklenenden hızlı yitirir.

Seçime ne zaman başlanmalı. Transfeksiyondan sonra puromisin eklemeden önce normal büyüme besiyerinde 48-72 saat bekleyin. Hücrelerin direnç kasetini eksprese etmesi için zamana ihtiyacı vardır; ilacı erken eklemek, PAC birikmeden başarıyla transfekte olmuş hücreleri öldürür. Lentiviral transdüksiyondan sonra 24-48 saat genellikle yeterlidir, çünkü entegre provirüsten ekspresyon hızla kurulur.

Öldürme eğrisi, transfekte edilmemiş hücrelerin %100'ünü hedeflenen seçim penceresi içinde öldüren en düşük derişimi belirleyen bir doz-yanıt deneyidir. Bundan fazlasını kullanmak daha güvenli değildir — gerçekten dirençli ama daha az eksprese eden klonları öldürme olasılığını artırır ve hedef dışı stres ekler.

Bunu, gerçek seçimde kullanacağınız hattın, pasaj aralığının ve besiyerinin tam olarak aynısında, transfekte edilmemiş ebeveyn hücrelerle çalıştırın.

0. gün — ekim

1. Canlılığı %90'ın üzerinde, log fazında büyüyen sağlıklı, yarı konflüent ebeveyn hücreleri toplayın.
2. Ertesi gün kabaca %50-70 konflüense ulaşacak bir yoğunlukta 24 kuyucuklu plakaya ekim yapın — hızlı büyüyen yapışkan bir hat için tipik olarak kuyucuk başına 2-5 x 10^4 hücre. 8 derişim için ikili ya da üçlü tekrarlara yetecek kadar kuyucuk ayırın.
3. Ekim yoğunluğunu planladığınız seçim yoğunluğuyla eşleştirin. Seyrek hücrelerle çalışılan bir öldürme eğrisi, yoğun bir plakada gereken derişimi olduğundan düşük gösterir.
4. Hücrelerin tutunup yeniden bölünmeye başlaması için gece boyunca puromisinsiz normal büyüme besiyerinde inkübe edin.

1. gün — doz serisini uygulayın

5. Tam büyüme besiyerinde bir seyreltme serisi hazırlayın. Standart seri 0 (uygulama yapılmayan kontrol), 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 ve 20 µg/mL'dir. Duyarlı olması beklenen bir hücre hattı için seriyi aşağı kaydırın (0 ile 5 µg/mL arası); dirençli olması beklenen bir hat için yukarı doğru genişletin.
6. Her kuyucuktaki besiyerini çekip yerine ilgili puromisin derişimini içeren besiyerini koyun. İlaçsız kontrol şarttır — gördüğünüz ölümün ilaçtan mı yoksa kültür koşullarından mı kaynaklandığını yalnızca o söyler.

2-10. günler — sürdürün ve gözleyin

7. Seçim besiyerini 2-3 günde bir, aynı derişimde taze hazırlanmış puromisinle değiştirin. En sık atlanan adım budur ve sonucu geçersiz kılar: puromisin, besiyeri içinde 37 °C'de birkaç gün içinde etkinliğini yitirir; ölen hücreler de etkin gücü daha da düşüren döküntü ve proteaz salar.
8. Her gün faz kontrast altında inceleyin. Her kuyucuktaki yuvarlaklaşmış, kalkmış veya yüzen hücrelerin oranını kaydedin. Kayıt istiyorsanız fotoğraflayın.
9. En çok 10 gün boyunca ya da uygulama yapılmayan kontrol konflüense ulaşıp durdurulması gerekene kadar sürdürün.

Sonucu okuma

10. Canlı hücre kalmayan en düşük derişimi belirleyin ve bunun hangi günde sağlandığını not edin. Puromisinde bu genellikle 2-5. gündür.
11. Kuyucuklar belirsizse gözle karar vermek yerine tripan mavisi sayımı ya da bir canlılık boyamasıyla doğrulayın.
12. Seçim için o derişimi kullanın. Birçok laboratuvar, yerleşmiş stabil hücre hatlarını sürekli ağır stres altında tutmadan seçilim baskısını korumak için seçim derişiminin yarısında idame ettirir.

Akıl sağlığı denetimleri. Uygulama yapılmayan kontrol sağlıksızsa eğrinin tamamı yorumlanamaz — deneyi tekrarlayın. 20 µg/mL'de bile hiçbir şey ölmüyorsa ilacın gerçekten eklendiğini, stoğun bozulmadığını ve hücrelerin önceki çalışmalardan kalma bir direnç belirteci taşımadığını denetleyin. Kontrol dahil her şey ölüyorsa ilacı suçlamadan önce besiyerine, plakaya ve inkübatöre bakın.

Zamanlama. Puromisini transfeksiyondan 48-72 saat sonra ya da transdüksiyondan 24-48 saat sonra ekleyin. Dirençli olmayan hücreler 24-48 saat içinde gözle görülür biçimde ölmeye başlamalı ve 3-5. güne kadar büyük ölçüde yok olmalıdır.

İlacı tazeleyin. Seçim besiyerini süreç boyunca 2-3 günde bir değiştirin. Bu, etkinliği korumanın yanı sıra kitlesel hücre ölümünün ürettiği ve aksi hâlde hayatta kalan kolonileri boğan büyük miktardaki döküntüyü de uzaklaştırır.

Bir öldürme kontrolü bulundurun. Her seçimin yanında, transfekte edilmemiş ebeveyn hücreleri puromisin içinde çalıştırın. Bunlar tamamen öldüğünde, o deneye özgü olarak seçilim baskısının varlığı kanıtlanmış olur. Bu kontrol olmadan, hayatta kalan hücrelerle dolu bir plaka belirsizdir — hücreler dirençli olabilir ya da ilaç hiç iş görmemiş olabilir.

Olağan başarısızlık nedeni yoğunluktur. PAC eksprese eden hücreler puromisini yok ettiği için, dirençli hücrelerden oluşan yoğun bir popülasyon, ilaç derişiminin dirençsiz hücrelerin hayatta kalmasına yetecek kadar düştüğü yerel bölgeler yaratır. Belirtileri, bir türlü temizlenmeyen transfekte edilmemiş hücre örtüsü ve düzgün çoğalamayan kolonilerdir. Çözüm, kültürü seçim boyunca yarı konflüent tutmak, yoğunlaştığında ilacı sürdürerek pasajlamak ve besiyerini sık değiştirmektir.

Beklenen süre. Seçim genellikle 3-7 günde tamamlanır. Klon izole ediyorsanız seçilim baskısını koloni çoğaltma aşaması boyunca sürdürün. Havuzlanmış popülasyonlarda ise öldürme kontrolü temizlendiği anda havuz çoğaltılabilir.

İdame. Yerleşmiş stabil hücre hatları çoğu kez seçim derişiminin yarısında idame ettirilir ya da kronik stresi azaltmak için dönüşümlü çalışılır — ilaçsız büyütülüp aralıklarla yeniden seçime alınır. Hücre hatları entegre kasetleri zamanla susturabildiği için, seçimin sürmesinin ekspresyonu garanti ettiğini varsaymak yerine ekspresyonu düzenli olarak doğrulayın.

Hayatta kalmayı yorumlarken bir uyarı. Puromisin, PAC eksprese eden hücreleri seçer. Yapınızın üzerindeki başka hiçbir şeyin ekspresyonunu seçmez. Direnç belirteci etkin kalırken aşağı akıştaki bir transgenin susturulması yaygındır; özellikle zayıf iç promotörlerde ve IRES'e bağlı kasetlerde. İlgilendiğiniz genin ekspresyonunu her zaman bağımsız bir yöntemle doğrulayın.

Stok hazırlama. Puromisin dihidroklorür suda kolayca çözünür. Standart stok, steril suda ya da HEPES ile tamponlanmış tuzlu çözeltide 10 mg/mL'dir ve 0,22 µm'den steril filtrelenir. Hazır 10 mg/mL çözeltiler yaygın olarak satılır ve tehlikeli bir tozu tartma zorunluluğunu ortadan kaldırır.

pH önemlidir. Puromisin, hafif asidikten nötre uzanan çözeltide — yaklaşık pH 6,0-7,0 — en kararlıdır ve alkali koşullarda gözle görülür biçimde bozunur. Stoğu alkali bir tamponda hazırlamayın ve CO2 kaybından alkaliye kaymış besiyerinde saklamaktan kaçının.

Saklama.

• Toz: -20 °C'de, nem almayacak biçimde ve ışıktan korunarak.
• 10 mg/mL sulu stok: -20 °C'de, ışıktan korunarak, tek kullanımlık alikotlar hâlinde. Bu koşullarda kabaca bir yıl kararlıdır.
• Kısa süreli çalışma stoğu: 2-8 °C'de yaklaşık bir aya kadar.
• Tekrarlı dondurma-çözmeden kaçının. Her döngü etkinlikten götürür; onlarca kez çözülmüş bir stok, başarısız seçimin sık rastlanan gizli nedenlerindendir. İlk çözmede 100-500 µL'lik alikotlara bölün.

Besiyeri içinde. Puromisin, tam besiyerinde 37 °C'de günler içinde etkinliğini yitirir. Seçim ve öldürme eğrisi sırasında besiyerinin 2-3 günde bir değiştirilmesinin nedeni budur. Büyük bir parti seçim besiyeri hazırlayıp iki hafta boyunca kullanmayın.

Işık. Stokları uzun süreli ışıktan koruyun. Tüpleri alüminyum folyoya sarmak yeterlidir.

Elleçleme. Puromisin bir protein sentezi inhibitörüdür ve toksiktir. Tozu solumamak için çeker ocakta ya da biyogüvenlik kabininde, eldiven ve göz koruması ile çalışın; çözeltileri kimyasal atık olarak bertaraf edin. Mümkün olan her yerde tozla uğraşmak yerine hazır çözelti kullanmak yeğlenmelidir.

Puromisin, çoğu stabil hücre hattı çalışmasında varsayılan tercihtir; çünkü hızlıdır, ucuzdur, düşük derişimde etkilidir ve küçük bir genle taşınır. Yine de her zaman doğru tercih değildir.

Puromisine yönelin: mümkün olan en kısa seçimi istiyorsanız, ekleme boyutunun kısıtlı olduğu viral bir vektörle çalışıyorsanız ya da hızın kaymayı azalttığı havuzlanmış bir kütüphaneyi seçiyorsanız.

Başka bir şeye yönelin:

• İkinci ya da üçüncü bir belirteç gerekiyorsa. Birden çok yapı için ardışık veya eşzamanlı seçim, birbirinden bağımsız ajanlar ister — direnç mekanizmaları örtüşmediği için puromisin, blastisidin ve higromisin yaygın bir üçlüdür.
• Hücre hattınız doğası gereği puromisine dirençliyse ya da hedef dışı toksisitenin sorun olacağı kadar yüksek bir derişim gerektiriyorsa.
• Yüksek eksprese eden klonlar için çok sıkı ve yavaş bir seçim gerekiyorsa. G418 seçimi daha yavaştır ve bazı gruplar tam bu nedenle yüksek eksprese eden stabil hücreleri daha iyi zenginleştirdiğini bulmuştur.
• Yüksek çoklu ilaç atım etkinliği olan hücrelerle çalışıyorsanız; bu hücrelerde puromisin aktif olarak dışarı atılabilir.

Ötekilerden farklı davranan Zeocin hakkında bir not: bir translasyon inhibitörü değil, DNA'yı kesen bir glikopeptittir; tam etkinlik için pH 7,0-7,5'te düşük tuzlu besiyeri ister ve ışığa güçlü biçimde duyarlıdır. Başarısız bir Zeocin seçimi çoğu kez bir doz sorunundan çok bir besiyeri bileşimi sorunudur.

Hangi ajanı kullanırsanız kullanın, öldürme eğrisi zorunluluğu aynıdır. Her ajan, her hücre hattı, her yeni parti.