Calcium- und Magnesium-freies DPBS, ohne Phenolrot

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• Kontamination in der ZellkulturKontamination in der Zellkultur lässt sich in sechs Kategorien einteilen: Bakterien, Hefen, Fadenpilze und Schimmel, Mykoplasmen, Viren sowie Kreuzkontamination durch eine andere Zelllinie. Bakterien, Hefen und Pilze melden sich innerhalb von einem bis fünf Tagen durch Trübung, eine pH-Verschiebung oder sichtbare Partikel im Mikroskop; man verwirft die Kultur und sucht den Technikfehler, der sie hineingelassen hat. Mykoplasmen, virale Kontamination und die Fehlidentifikation von Zelllinien verursachen überhaupt keine sichtbare Veränderung und werden nur durch gezielte Testung gefunden — PCR oder DNA-Färbung bei Mykoplasmen, STR-Analyse für die Identität. Die richtige Reaktion auf jede bestätigte biologische Kontamination lautet: betroffene Kultur verwerfen, den Inkubator dekontaminieren und aus einem sauberen kryokonservierten Stock neu starten.
• Zellzählung mit der ZählkammerEine Zählkammer ist ein dicker Glasobjektträger mit präzise eingeätztem Gitter, über dem ein Deckglas eine genau 0.1 mm tiefe Kammer bildet, sodass sich ein bekanntes Volumen einer Zellsuspension unter dem Mikroskop auszählen und in eine Konzentration umrechnen lässt. Bei Säugerzellen zählt man die vier Eckquadrate von je 1 mm2, bildet den Mittelwert, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor und mit 10^4 und erhält so Zellen pro mL — denn jedes Eckquadrat umschließt genau 10^-4 mL. Mischt man die Probe vor dem Befüllen 1:1 mit 0.4% Trypanblau, liefert dieselbe Zählung zugleich den Viabilitätsanteil, da nur tote Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen.
• HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung)HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung) ist eine isotone ausgewogene Salzlösung zum Waschen von Zellen, zum Transport von Gewebe, zum Verdünnen von Reagenzien und zum kurzzeitigen Halten von Zellen außerhalb ihres Wachstumsmediums. Sie enthält 8.0 g/L Natriumchlorid, 1.0 g/L D-Glucose, Phosphat und 350 mg/L Natriumbicarbonat und wird entweder mit Calcium und Magnesium (1.26 mM Ca, ~0.9 mM Mg gesamt) oder ohne diese geliefert. Der niedrige Bicarbonatgehalt bedeutet, dass HBSS für den Einsatz bei atmosphärischem CO2 oder in verschlossenen Gefäßen ausgelegt ist, nicht für längere Kultur im 5% CO2-Inkubator.
• Trypanblau und der Farbstoffausschlusstest zur ViabilitätsbestimmungTrypanblau ist ein Diazofarbstoff, der als 0.4% (w/v) Lösung eingesetzt wird, um lebende von toten Zellen über den Farbstoffausschluss zu unterscheiden: Eine intakte Plasmamembran hält den geladenen Farbstoff draußen, sodass lebensfähige Zellen klar und lichtbrechend bleiben, während Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen und sich blau anfärben. In der Praxis wird die Zellsuspension 1:1 mit 0.4% Trypanblau gemischt, in eine Zählkammer oder ein automatisches Zellzählgerät gegeben und innerhalb von 3-5 Minuten ausgezählt, was gleichzeitig eine Zellkonzentration und eine prozentuale Viabilität liefert. Da nur die Membranintegrität erfasst wird, zählt Trypanblau Zellen, die bereits gestorben sind — apoptotische oder metabolisch versagende Zellen mit noch intakter Membran erkennt es nicht, sodass die Werte im Vergleich zu metabolischen oder durchflusszytometrischen Viabilitätstests zu hoch ausfallen.
• ACK-LysepufferDer ACK-Lysepuffer (Ammonium-Chloride-Potassium) ist eine isotone Ammoniumchloridlösung, mit der Erythrozyten aus Leukozytenpräparationen wie Mausmilz, Knochenmark und Buffy Coat entfernt werden. Die Standardzusammensetzung besteht aus 150 mM Ammoniumchlorid (8.02 g/L NH4Cl), 10 mM Kaliumbicarbonat (1.0 g/L KHCO3) und 0.1 mM Dinatrium-EDTA, eingestellt auf pH 7.2-7.4. Erythrozyten lysieren bei Raumtemperatur innerhalb von einer bis fünf Minuten osmotisch, weil ihr Bande-3-Anionenaustauscher und ihre hohe Carboanhydrase-Aktivität Ammoniumchlorid und Wasser in die Zelle treiben, während Leukozyten, denen diese Transportkapazität fehlt, überleben.
• Trypsin-EDTATrypsin-EDTA ist ein Reagenz zur Zelldissoziation, das die Serinprotease Trypsin — sie spaltet Peptidbindungen C-terminal von Lysin- und Argininresten in Zelloberflächen- und Matrixproteinen — mit dem Komplexbildner EDTA kombiniert, der die von Zelladhäsionsmolekülen benötigten Calcium- und Magnesiumionen bindet. Geliefert wird es in einer Calcium- und Magnesium-freien ausgewogenen Salzlösung, meist mit 0.05% Trypsin (0.5 g/L) für gängige Zelllinien und 0.25% (2.5 g/L) für fest anhaftende Zellen und Primärkulturen. Üblich sind 2-5 Minuten bei 37 °C, gefolgt von der sofortigen Neutralisation mit serumhaltigem Medium oder einem definierten Trypsininhibitor.
• PBS und DPBS: Was sich unterscheidet und welche Lösung Sie brauchenPBS und DPBS sind beide phosphatgepufferte Kochsalzlösungen; der Unterschied liegt in der Rezeptur, nicht in der Funktion. Dulbeccos Formulierung (DPBS) enthält zusätzlich Kaliumchlorid und rund doppelt so viel Phosphat wie ein typisches PBS (etwa 9.5 mM gegenüber etwa 4 mM), und sie wird in zwei Varianten verkauft — mit Calcium und Magnesium sowie ohne. In der Praxis zählt die Entscheidung mit oder ohne zweiwertige Kationen weit mehr als die Aufschrift PBS oder DPBS: Verwenden Sie eine calcium- und magnesiumfreie Lösung, um Zellen vor der Trypsinierung oder der Ablösung mit EDTA zu waschen, denn Ca2+ und Mg2+ stützen genau die Cadherin- und Integrinbindungen, die Sie gleich lösen wollen; und verwenden Sie die Variante mit Calcium und Magnesium, wenn die Zellen den Waschschritt angeheftet und unversehrt überstehen sollen.
• DF-1 Hühnerembryo-FibroblastenzellenDF-1 (UMNSAH/DF-1, ATCC CRL-12203) ist eine spontan immortalisierte Hühnerembryo-Fibroblastenlinie, die aus Embryonen der East Lansing Line 0 stammt -- einer Hühnerlinie ohne endogene Loci des aviären Leukosevirus. Da sie kein endogenes Retrovirus trägt und ohne virale oder chemische Transformation immortalisiert wurde, ist sie der etablierte kontinuierliche Ersatz für primäre Hühnerembryo-Fibroblasten in der aviären Virologie, der Impfstoffentwicklung und der Herstellung rekombinanter Viren. DF-1-Zellen werden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und 10% fetalem Kälberserum bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert, wachsen schneller als primäre CEF, lassen sich effizient transfizieren und unterstützen die Replikation von aviärer Influenza, dem Virus der infektiösen Bursitis, aviären Leukose- und Sarkomviren sowie vielen weiteren aviären Erregern mit Titern, die denen auf CEF entsprechen oder darüber liegen.
• Subkultivierung von Zellen (Passagieren)Die Subkultivierung von Zellen, auch Passagieren genannt, ist die Überführung von Zellen aus einer Kultur, die sich der Konfluenz nähert, in frische Gefäße mit frischem Medium, damit das Wachstum weitergehen kann. Adhärente Zellen werden zuerst abgelöst, meist mit 0.25% oder 0.05% Trypsin-EDTA oder einem nicht enzymatischen Dissoziationsreagenz, und dann in geringerer Dichte neu ausgesät, festgelegt durch ein Teilungsverhältnis wie 1:4; Suspensionszellen werden ohne jeden Dissoziationsschritt einfach in frisches Medium verdünnt. Die meisten kontinuierlichen adhärenten Zelllinien werden bei 70-80% Konfluenz subkultiviert, was in der Regel zwei bis drei Passagen pro Woche bedeutet.
• Puffer in der ZellkulturZellkulturpuffer halten das Medium in dem Bereich von pH 7.2-7.4, den Säugerzellen benötigen, und zwar gegen die Säurelast, die die Zellen beim Stoffwechsel erzeugen. Das Standardsystem nahezu jedes klassischen Mediums ist Natriumbicarbonat im Zusammenspiel mit dem CO2 der Inkubatoratmosphäre; deshalb muss der Bicarbonatgehalt zur Einstellung des Inkubators passen: etwa 1.5-2.2 g/L NaHCO3 bei 5% CO2 und 3.7 g/L bei 10% CO2. Organische Puffer wie HEPES (pKa 7.48) werden mit 10-25 mM zugesetzt, um den pH-Wert außerhalb einer CO2-Atmosphäre zu halten, während phosphatgepufferte Lösungen wie PBS und DPBS zum Waschen und für kurze Handhabungsschritte dienen, nicht zum Wachstum.
• Einfriermedium für Zellen und Protokolle zur KryokonservierungEin Einfriermedium für Zellen ist eine Lösung mit Kryoprotektivum, die Zellen das Einfrieren und die Langzeitlagerung überstehen lässt; am häufigsten besteht es aus einem Basalmedium oder Serum mit 5-10% Dimethylsulfoxid (DMSO), wobei 10% der Standardausgangspunkt ist. DMSO dringt in die Zelle ein und verändert, wie Wasser gefriert; so werden die intrazellulären Eiskristalle verhindert, die sonst beim Abkühlen die Membranen zerreißen. Zellen werden mit einer definierten Abkühlrate von etwa 1 C pro Minute auf -80 C gebracht und anschließend in die Gasphase über flüssigem Stickstoff überführt, denn die Langzeitlagerung erfordert Temperaturen unterhalb von etwa -135 C, damit Eis nicht rekristallisiert. Das Auftauen verläuft umgekehrt - so schnell wie möglich im 37-C-Wasserbad, gefolgt von zügigem Verdünnen, um das DMSO zu entfernen, das oberhalb des Gefrierpunkts für Zellen toxisch ist.
• Trypsin vs. Accutase: Das richtige Zelldissoziationsreagenz wählenTrypsin ist eine Serinprotease aus dem Pankreas, die Peptidbindungen nach Lysin und Arginin spaltet. Sie löst Zellen schnell, aber unselektiv ab, muss mit Serum oder einem Trypsininhibitor gestoppt werden und spaltet neben den Adhäsionskontakten auch Oberflächenproteine. Accutase ist eine proprietäre Mischung proteolytischer und kollagenolytischer Enzyme aus einer wirbellosen Quelle, geliefert in calcium- und magnesiumfreiem DPBS mit 0.5 mM EDTA; sie wirkt langsamer und schonender, benötigt keinen Neutralisationsschritt und erhält mehr Oberflächenepitope. Wählen Sie Trypsin für das routinemäßige Passagieren robuster adhärenter Linien, wenn es auf Tempo ankommt und die Zellen direkt zurück in Kultur gehen; wählen Sie Accutase, wenn die geernteten Zellen selbst das Experiment sind — Durchflusszytometrie auf Oberflächenmarker, pluripotente Stammzellen, primäre Neurone oder jede Einzelzellsuspension, in der Lebensfähigkeit und Phänotyp die Ernte überstehen müssen.