0.4% Trypan Blue Lösung

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• Kontamination in der ZellkulturKontamination in der Zellkultur lässt sich in sechs Kategorien einteilen: Bakterien, Hefen, Fadenpilze und Schimmel, Mykoplasmen, Viren sowie Kreuzkontamination durch eine andere Zelllinie. Bakterien, Hefen und Pilze melden sich innerhalb von einem bis fünf Tagen durch Trübung, eine pH-Verschiebung oder sichtbare Partikel im Mikroskop; man verwirft die Kultur und sucht den Technikfehler, der sie hineingelassen hat. Mykoplasmen, virale Kontamination und die Fehlidentifikation von Zelllinien verursachen überhaupt keine sichtbare Veränderung und werden nur durch gezielte Testung gefunden — PCR oder DNA-Färbung bei Mykoplasmen, STR-Analyse für die Identität. Die richtige Reaktion auf jede bestätigte biologische Kontamination lautet: betroffene Kultur verwerfen, den Inkubator dekontaminieren und aus einem sauberen kryokonservierten Stock neu starten.
• Zellzählung mit der ZählkammerEine Zählkammer ist ein dicker Glasobjektträger mit präzise eingeätztem Gitter, über dem ein Deckglas eine genau 0.1 mm tiefe Kammer bildet, sodass sich ein bekanntes Volumen einer Zellsuspension unter dem Mikroskop auszählen und in eine Konzentration umrechnen lässt. Bei Säugerzellen zählt man die vier Eckquadrate von je 1 mm2, bildet den Mittelwert, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor und mit 10^4 und erhält so Zellen pro mL — denn jedes Eckquadrat umschließt genau 10^-4 mL. Mischt man die Probe vor dem Befüllen 1:1 mit 0.4% Trypanblau, liefert dieselbe Zählung zugleich den Viabilitätsanteil, da nur tote Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen.
• Trypanblau und der Farbstoffausschlusstest zur ViabilitätsbestimmungTrypanblau ist ein Diazofarbstoff, der als 0.4% (w/v) Lösung eingesetzt wird, um lebende von toten Zellen über den Farbstoffausschluss zu unterscheiden: Eine intakte Plasmamembran hält den geladenen Farbstoff draußen, sodass lebensfähige Zellen klar und lichtbrechend bleiben, während Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen und sich blau anfärben. In der Praxis wird die Zellsuspension 1:1 mit 0.4% Trypanblau gemischt, in eine Zählkammer oder ein automatisches Zellzählgerät gegeben und innerhalb von 3-5 Minuten ausgezählt, was gleichzeitig eine Zellkonzentration und eine prozentuale Viabilität liefert. Da nur die Membranintegrität erfasst wird, zählt Trypanblau Zellen, die bereits gestorben sind — apoptotische oder metabolisch versagende Zellen mit noch intakter Membran erkennt es nicht, sodass die Werte im Vergleich zu metabolischen oder durchflusszytometrischen Viabilitätstests zu hoch ausfallen.
• ACK-LysepufferDer ACK-Lysepuffer (Ammonium-Chloride-Potassium) ist eine isotone Ammoniumchloridlösung, mit der Erythrozyten aus Leukozytenpräparationen wie Mausmilz, Knochenmark und Buffy Coat entfernt werden. Die Standardzusammensetzung besteht aus 150 mM Ammoniumchlorid (8.02 g/L NH4Cl), 10 mM Kaliumbicarbonat (1.0 g/L KHCO3) und 0.1 mM Dinatrium-EDTA, eingestellt auf pH 7.2-7.4. Erythrozyten lysieren bei Raumtemperatur innerhalb von einer bis fünf Minuten osmotisch, weil ihr Bande-3-Anionenaustauscher und ihre hohe Carboanhydrase-Aktivität Ammoniumchlorid und Wasser in die Zelle treiben, während Leukozyten, denen diese Transportkapazität fehlt, überleben.
• Puromycin zur Selektion von SäugerzellenPuromycin ist ein Aminonukleosid-Antibiotikum aus Streptomyces alboniger, das das Aminoacyl-Ende der tRNA nachahmt, in die A-Stelle des Ribosoms eintritt und die vorzeitige Freisetzung einer verkürzten Peptidkette auslöst, wodurch Zellen absterben, die es nicht inaktivieren können. In der Säugerzellkultur dient es als Selektionsantibiotikum bei 0.5-10 ug/mL, am häufigsten bei 1-2 ug/mL, und es tötet nicht resistente Zellen schneller ab als jedes andere gebräuchliche Selektionsantibiotikum — typischerweise innerhalb von 2-5 Tagen. Die Resistenz vermittelt das pac-Gen, das für die Puromycin-N-Acetyltransferase codiert; diese acetyliert den Wirkstoff und macht ihn unwirksam. Da die wirksame Konzentration stark von Zelllinie, Zelldichte und Serumgehalt abhängt, muss für jede neue Zelllinie und jede neue Puromycin-Charge eine Abtötungskurve erstellt werden.
• Sf9-Zellen und das Baculovirus-ExpressionssystemSf9 ist eine klonale Insektenzelllinie, die aus Sf21 isoliert wurde; Sf21 wiederum wurde aus dem Ovarialgewebe von Puppen des Herbst-Heerwurms *Spodoptera frugiperda* etabliert. Sf9 ist der Standardwirt für das Baculovirus-Expressionsvektorsystem und dient der Herstellung rekombinanter Proteine, virusähnlicher Partikel und von AAV. Sf9-Zellen wachsen bei 27 C ohne CO2 in phosphatgepufferten Insektenmedien bei pH 6.2-6.4, passen sich bereitwillig an die serumfreie Suspensionskultur bei 100-130 rpm an und verdoppeln sich alle 18-24 Stunden. Kulturen werden bei etwa 2.5-3.5 x 10^6 Zellen/mL passagiert und auf rund 1 x 10^6 Zellen/mL zurückverdünnt; infiziert wird an gesunden Zellen in der log-Phase mit einer Lebensfähigkeit über 95 %.
• DF-1 Hühnerembryo-FibroblastenzellenDF-1 (UMNSAH/DF-1, ATCC CRL-12203) ist eine spontan immortalisierte Hühnerembryo-Fibroblastenlinie, die aus Embryonen der East Lansing Line 0 stammt -- einer Hühnerlinie ohne endogene Loci des aviären Leukosevirus. Da sie kein endogenes Retrovirus trägt und ohne virale oder chemische Transformation immortalisiert wurde, ist sie der etablierte kontinuierliche Ersatz für primäre Hühnerembryo-Fibroblasten in der aviären Virologie, der Impfstoffentwicklung und der Herstellung rekombinanter Viren. DF-1-Zellen werden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und 10% fetalem Kälberserum bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert, wachsen schneller als primäre CEF, lassen sich effizient transfizieren und unterstützen die Replikation von aviärer Influenza, dem Virus der infektiösen Bursitis, aviären Leukose- und Sarkomviren sowie vielen weiteren aviären Erregern mit Titern, die denen auf CEF entsprechen oder darüber liegen.
• Subkultivierung von Zellen (Passagieren)Die Subkultivierung von Zellen, auch Passagieren genannt, ist die Überführung von Zellen aus einer Kultur, die sich der Konfluenz nähert, in frische Gefäße mit frischem Medium, damit das Wachstum weitergehen kann. Adhärente Zellen werden zuerst abgelöst, meist mit 0.25% oder 0.05% Trypsin-EDTA oder einem nicht enzymatischen Dissoziationsreagenz, und dann in geringerer Dichte neu ausgesät, festgelegt durch ein Teilungsverhältnis wie 1:4; Suspensionszellen werden ohne jeden Dissoziationsschritt einfach in frisches Medium verdünnt. Die meisten kontinuierlichen adhärenten Zelllinien werden bei 70-80% Konfluenz subkultiviert, was in der Regel zwei bis drei Passagen pro Woche bedeutet.
• Einfriermedium für Zellen und Protokolle zur KryokonservierungEin Einfriermedium für Zellen ist eine Lösung mit Kryoprotektivum, die Zellen das Einfrieren und die Langzeitlagerung überstehen lässt; am häufigsten besteht es aus einem Basalmedium oder Serum mit 5-10% Dimethylsulfoxid (DMSO), wobei 10% der Standardausgangspunkt ist. DMSO dringt in die Zelle ein und verändert, wie Wasser gefriert; so werden die intrazellulären Eiskristalle verhindert, die sonst beim Abkühlen die Membranen zerreißen. Zellen werden mit einer definierten Abkühlrate von etwa 1 C pro Minute auf -80 C gebracht und anschließend in die Gasphase über flüssigem Stickstoff überführt, denn die Langzeitlagerung erfordert Temperaturen unterhalb von etwa -135 C, damit Eis nicht rekristallisiert. Das Auftauen verläuft umgekehrt - so schnell wie möglich im 37-C-Wasserbad, gefolgt von zügigem Verdünnen, um das DMSO zu entfernen, das oberhalb des Gefrierpunkts für Zellen toxisch ist.