Chemisch definiertes, enzymfreies Zelldissoziationsmedium

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• Chemisch definiertes MediumEin chemisch definiertes Medium ist ein Zellkulturmedium, bei dem Identität und Konzentration jedes einzelnen Bestandteils bekannt sind — kein Serum, keine Proteinhydrolysate, keine undefinierten Extrakte. Es darf dennoch Proteine enthalten, sofern diese rekombinant sind und in bekannter Sequenz und Konzentration vorliegen; genau deshalb sind chemisch definiert und proteinfrei zwei verschiedene Kategorien und keine Synonyme. Chemisch definierte Medien beseitigen die Chargenschwankungen, das Fremdagenzien-Risiko und den regulatorischen Aufwand des Serums und sind der Standard für die biopharmazeutische Produktion in CHO-, HEK293- und Hybridomsystemen.
• Zellzählung mit der ZählkammerEine Zählkammer ist ein dicker Glasobjektträger mit präzise eingeätztem Gitter, über dem ein Deckglas eine genau 0.1 mm tiefe Kammer bildet, sodass sich ein bekanntes Volumen einer Zellsuspension unter dem Mikroskop auszählen und in eine Konzentration umrechnen lässt. Bei Säugerzellen zählt man die vier Eckquadrate von je 1 mm2, bildet den Mittelwert, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor und mit 10^4 und erhält so Zellen pro mL — denn jedes Eckquadrat umschließt genau 10^-4 mL. Mischt man die Probe vor dem Befüllen 1:1 mit 0.4% Trypanblau, liefert dieselbe Zählung zugleich den Viabilitätsanteil, da nur tote Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen.
• Trypsin-EDTATrypsin-EDTA ist ein Reagenz zur Zelldissoziation, das die Serinprotease Trypsin — sie spaltet Peptidbindungen C-terminal von Lysin- und Argininresten in Zelloberflächen- und Matrixproteinen — mit dem Komplexbildner EDTA kombiniert, der die von Zelladhäsionsmolekülen benötigten Calcium- und Magnesiumionen bindet. Geliefert wird es in einer Calcium- und Magnesium-freien ausgewogenen Salzlösung, meist mit 0.05% Trypsin (0.5 g/L) für gängige Zelllinien und 0.25% (2.5 g/L) für fest anhaftende Zellen und Primärkulturen. Üblich sind 2-5 Minuten bei 37 °C, gefolgt von der sofortigen Neutralisation mit serumhaltigem Medium oder einem definierten Trypsininhibitor.
• Subkultivierung von Zellen (Passagieren)Die Subkultivierung von Zellen, auch Passagieren genannt, ist die Überführung von Zellen aus einer Kultur, die sich der Konfluenz nähert, in frische Gefäße mit frischem Medium, damit das Wachstum weitergehen kann. Adhärente Zellen werden zuerst abgelöst, meist mit 0.25% oder 0.05% Trypsin-EDTA oder einem nicht enzymatischen Dissoziationsreagenz, und dann in geringerer Dichte neu ausgesät, festgelegt durch ein Teilungsverhältnis wie 1:4; Suspensionszellen werden ohne jeden Dissoziationsschritt einfach in frisches Medium verdünnt. Die meisten kontinuierlichen adhärenten Zelllinien werden bei 70-80% Konfluenz subkultiviert, was in der Regel zwei bis drei Passagen pro Woche bedeutet.
• Trypsin vs. Accutase: Das richtige Zelldissoziationsreagenz wählenTrypsin ist eine Serinprotease aus dem Pankreas, die Peptidbindungen nach Lysin und Arginin spaltet. Sie löst Zellen schnell, aber unselektiv ab, muss mit Serum oder einem Trypsininhibitor gestoppt werden und spaltet neben den Adhäsionskontakten auch Oberflächenproteine. Accutase ist eine proprietäre Mischung proteolytischer und kollagenolytischer Enzyme aus einer wirbellosen Quelle, geliefert in calcium- und magnesiumfreiem DPBS mit 0.5 mM EDTA; sie wirkt langsamer und schonender, benötigt keinen Neutralisationsschritt und erhält mehr Oberflächenepitope. Wählen Sie Trypsin für das routinemäßige Passagieren robuster adhärenter Linien, wenn es auf Tempo ankommt und die Zellen direkt zurück in Kultur gehen; wählen Sie Accutase, wenn die geernteten Zellen selbst das Experiment sind — Durchflusszytometrie auf Oberflächenmarker, pluripotente Stammzellen, primäre Neurone oder jede Einzelzellsuspension, in der Lebensfähigkeit und Phänotyp die Ernte überstehen müssen.