RPMI 1640 培地

RPMI 1640 は、ニューヨーク州バッファローの Roswell Park Memorial Institute で George Moore、Robert Gerner、H. Addison Franklin によって開発され、正常ヒト白血球の培養に関する論文として 1967 年に発表されました。RPMI は研究所の頭文字、1640 は一連の処方に付けられた番号です。出発点は McCoy's 5A（これ自体が RPMI 1630 と呼ばれることもあります）の改変で、狙いは Eagle 系の培地が苦手としていた問題、すなわちリンパ芽球様細胞を浮遊で増やすことにありました。

この成り立ちが、この培地の特徴のほとんどを説明します。浮遊細胞は接着を促す高いカルシウムを必要とせず、むしろ抑制されます。数日にわたって培養する白血球には、標準的なインキュベーターの CO2 濃度で保つ緩衝系が要ります。さらに、酸化還元状態に敏感な細胞を支える必要がありました。古典的な基礎培地としてはほぼ唯一、還元型グルタチオンを含むのはそのためです。

その後 RPMI 1640 は、名前から受ける印象よりずっと汎用性が高いことがわかってきました。多くの接着系細胞株も問題なく増え、NCI-60 腫瘍パネル、ハイブリドーマ培養、末梢血単核球の実験、そしてヒト白血病・リンパ腫細胞株の大半で標準のベースになっています。

主要メーカーが供給している標準的な RPMI 1640 の処方です。

無機塩とバルク成分

アミノ酸（mg/L）

L-アルギニン 200、L-アスパラギン 50、L-アスパラギン酸 20、L-シスチン·2HCl 65、L-グルタミン酸 20、グリシン 10、L-ヒスチジン 15、L-ヒドロキシプロリン 20、L-イソロイシン 50、L-ロイシン 50、L-リシン·HCl 40、L-メチオニン 15、L-フェニルアラニン 15、L-プロリン 20、L-セリン 30、L-トレオニン 20、L-トリプトファン 5、L-チロシン二ナトリウム塩二水和物 29、L-バリン 20。

ビタミン（mg/L）

i-イノシトール 35、塩化コリン 3、パラアミノ安息香酸 1、葉酸 1、ニコチンアミド 1、チアミン·HCl 1、D-パントテン酸カルシウム 0.25、ビオチン 0.2、リボフラビン 0.2、ビタミン B12（シアノコバラミン） 0.005。

この一覧で立ち止まる価値があるのは四点です。RPMI を RPMI たらしめているのは、この四つだからです。

• カルシウムが非常に低い。 0.42 mM で、DMEM や MEM の 1.8 mM を大きく下回ります。これは意図的です。カルシウムが低いと、浮遊培養を台無しにする細胞どうし・細胞と基質の接着が起こりにくくなります。
• リン酸が非常に高い。 リン酸水素二ナトリウムだけでおよそ 5.6 mM、DMEM のおよそ 6 倍です。重炭酸に加えて意味のある二次的な緩衝能を与え、日常の取り扱いでの安定性にも寄与します。
• 還元型グルタチオンが入っている。 1 mg/L です。ほかの古典的な基礎培地には入っていません。抗酸化能を与え、初代白血球では効いてきます。
• ビオチン、ビタミン B12、PABA、ヒドロキシプロリンが入っている。 いずれも DMEM や MEM にはありません。アミノ酸濃度はずっと低いにもかかわらず、ビタミンの守備範囲は Eagle 系の培地より広くなっています。

欠けているものにも注意してください。RPMI には鉄源も微量元素も含まれていません。これらは血清が供給します。

RPMI 1640 は D-glucose を 2,000 mg/L、つまり 2.0 g/L（11.1 mM）含みます。 これは標準処方の値で、どのメーカーでも同じです。RPMI 1640 は独自処方ではなく、公表された標準処方だからです。あるメーカーのデータシートを、別のメーカー向けに書かれたプロトコルと突き合わせる場合でも、製品名に別の記載がなければグルコースはすべて 2.0 g/L です。

例外は、はっきりそう表示された派生品だけです。

• ATCC 改変 RPMI 1640 はグルコースを 4,500 mg/L（4.5 g/L、25 mM）に引き上げ、1 mM のピルビン酸ナトリウムと 10 mM の HEPES を加えています。
• グルコース不含 RPMI 1640 はグルコースを含まず、炭素源を自分で設定する代謝研究に使います。
• HEPES 入り RPMI 1640 はグルコースを 2.0 g/L のままにして、緩衝剤を加えたものです。

11.1 mM という値は、血中のグルコース濃度に近く、高グルコース DMEM のおよそ半分です。代謝やイムノメタボリズムの実験では、これは本物の利点になります。25 mM のグルコースは薬理学的な濃度であり、多くの細胞種で酸化的リン酸化を抑えてしまうからです。一方、非常に密な培養では不利で、早く使い切るぶん給餌の頻度を上げる必要があります。

RPMI 1640 の使用時の pH は 7.2 ± 0.2 です。 5% CO2 で平衡化した完全培地で測定した値です。重炭酸緩衝の培地はどれもそうですが、冷えたボトルを実験台で測ると、溶存 CO2 が抜けているぶん高めに出ます。インキュベーターに戻せば規格値に戻ります。RPMI はリン酸濃度が高いため、DMEM より CO2 に依存しない緩衝能が大きく、取り扱い中の変動もゆっくりです。

最もよく使われる二つの基礎培地ですが、互いに置き換えられるものではありません。大きな違いはカルシウム、リン酸、グルコース、アミノ酸濃度、重炭酸です。このページ下部の比較表に、成分レベルの違いと、それぞれが実務で何を意味するかをまとめてあります。

実務上の判断は、たいてい三つの問いに落ち着きます。

浮遊か、接着か。 浮遊のリンパ系・造血系細胞は RPMI です。しっかり接着する線維芽細胞系・上皮系の細胞株は DMEM です。RPMI の低いカルシウムは強い接着に不利で、DMEM の 1.8 mM のカルシウムはそれを支えます。

その細胞株の公表プロトコルは何と言っているか。 樹立株では、これは好みの問題ではありません。Jurkat、K562、THP-1、Raji、U937、HL-60、MOLT-4、NCI-60 パネルの大半、そしてハイブリドーマの多くは、参照プロトコルで RPMI 1640 が指定されています。HEK293、HeLa、NIH/3T3、Vero、COS-7、C2C12 は DMEM です。細胞株をこの二つのあいだで乗り換えると、倍加時間、飽和密度、しばしばタンパク質発現まで変わります。改めて特性解析をしない限り、文献との比較が成り立たなくなります。

代謝の要求はどれくらいか。 DMEM はグルコース 25 mM、アミノ酸濃度は RPMI のおよそ 4 倍で、密で速く、要求の高い培養向けに設計されています。RPMI はグルコース 11 mM、アミノ酸も控えめで、数日かけて中程度の速度で浮遊増殖する細胞向けです。要求の高い培養を RPMI で押し切るなら、そのぶん頻繁に給餌することになります。

本当に役に立つ折衷案が一つあります。ATCC 改変 RPMI 1640 です。グルコースを 4.5 g/L に引き上げ、1 mM のピルビン酸ナトリウムと 10 mM の HEPES を加えたもので、RPMI のイオン組成としての性格を残しつつ、高グルコース培地の栄養の蓄えを持たせています。RPMI でなければならないが高密度まで増やしたい、ハイブリドーマなどの培養に向いています。

樹立されたリンパ系・造血系細胞株。 Jurkat、K562、HL-60、THP-1、U937、Raji、Ramos、MOLT-4、Daudi、そして B 系・T 系リンパ芽球様細胞株の大半です。標準的な添加は 10% FBS と 2 mM の L-glutamine です。

ヒト初代白血球。 PBMC、分離した T 細胞、B 細胞、単球、樹状細胞の培養。RPMI が本来想定していた用途です。長期の初代培養では、RPMI のグルタチオン含量と広いビタミンの守備範囲が意味のある利点になります。

ハイブリドーマと抗体産生。 RPMI 1640 は追加の添加物と組み合わせて使われることが多く、古典的なハイブリドーマ用ベースです。生産には化学組成既知のハイブリドーマ用培地が主流になりましたが、融合とクローニングでは RPMI が標準のままです。

多くの接着系腫瘍細胞株。 MCF-7、A549、PC-3、HT-29、SK-MEL をはじめ、非常に多くの株が日常的に RPMI で維持されています。RPMI は浮遊細胞専用、という決まりはありません。NCI-60 パネルは接着系も浮遊系も含めて RPMI で育てられています。

RPMI が向かない場面： 接合部の形成や分化に高いカルシウムが必要な細胞、改変処方なしでの超高密度の流加培養、そして血清なしでの低密度クローン増殖です。最後のものには F-12 系か、その目的で設計されたベースが要ります。

RPMI 1640 の炭酸水素ナトリウム 2,000 mg/L（23.8 mM）は、5% CO2 の雰囲気に合わせてあります。ほぼすべてのインキュベーターがこの設定です。これは DMEM に対する RPMI の地味な実用上の強みの一つで、DMEM の 3,700 mg/L の重炭酸は 10% CO2 向けに処方されているため、5% ではアルカリ側に振れます。

RPMI はリン酸が高いので、CO2 に依存しない二次的な緩衝も効きます。同じ重炭酸濃度でリン酸の低い培地に比べれば、実験台に置いている時間に強くなります。それでも開けたままにすれば CO2 が抜けてアルカリ側に流れるので、ボトルを開けている時間は短く保ってください。

HEPES 入りの派生品は 25 mM（ATCC 改変では 10 mM）で供給されます。フローサイトメトリー、ライブセルイメージング、長時間のソーティング、そのほか細胞を CO2 雰囲気の外に数分以上置くプロトコルで使ってください。注意点が二つあります。HEPES は光に当たると過酸化水素を生じます。また 25 mM では、一部の初代細胞に対して毒性を示します。無条件の格上げとして扱わないでください。

フェノールレッド不含の RPMI は、蛍光・吸光アッセイ、フェノールレッドがバックグラウンドを上げるフローサイトメトリー、そしてホルモン応答の実験のために用意されています。フェノールレッドには弱いエストロゲン様活性があり、MCF-7 のようなエストロゲン受容体陽性株では交絡因子として報告されています。

血清。 10% FBS が標準です。初代培養や低密度の培養では 20% を使うプロトコルもあり、よく馴化した株では 5% にすることもあります。

グルタミン。 グルタミン含有版の RPMI には 300 mg/L（約 2 mM）が入っています。グルタミンは溶液中でアンモニアに分解するため、グルタミン不含の RPMI を買って使用時に新しく加えるか、安定なジペプチドである L-alanyl-L-glutamine を使うほうが結果は安定します。とくに 2 日おきではなく週 1 回の給餌で回す培養で効いてきます。

2-メルカプトエタノール。 初代リンパ球、ハイブリドーマ、マウス T 細胞の培養では 50 µM が標準です。シスチンの取り込みを助け、細胞内グルタチオンの維持を支えます。一部の初代培養では、あってもなくてもよい追加ではなく、本当に必要な項目です。

ピルビン酸ナトリウムと非必須アミノ酸。 1 mM のピルビン酸と 1x の NEAA はよく加えられます。とくに NCI-60 のプロトコルや、血清を減らした培養でそうです。RPMI にはもともと非必須アミノ酸がいくつか入っているので、NEAA を足したときの上積みは DMEM ほど大きくありません。

グルコース不含 RPMI は代謝研究に使います。ガラクトースに置き換えて酸化的代謝を強制する、あるいはグルコースを狙った濃度に振る、といった用途です。RPMI はもともとのグルコースが生理的な値に近いぶん、DMEM よりこの用途のベースに向いています。

粉末の RPMI は、規模が大きいときの経済的な選択肢です。炭酸水素ナトリウムを含まない形で供給されるので、溶解時に加え（2.0 g/L）、濾過中に pH が上がるぶんを見込んで目標より 0.1–0.2 単位ほど低く調整し、0.22 µm で滅菌濾過します。

液体の RPMI 1640 は、遮光して 2–8 °C で保存します。未開封の有効期間は 12–24 か月が一般的です。グルタミンを加えたあとは、使える期間はおよそ 4 週間と見てください。血清を加えた培地なら 2〜4 週間です。

保存で最も過小評価されているのが光です。リボフラビン、葉酸、トリプトファンは光で分解し、HEPES が入っていればその反応で過酸化水素が生じます。実験室の照明の下、開いた棚に置いた培地は、測定できるほどプレーティング効率が落ちます。ボトルは扉のある冷蔵庫に入れてください。照明付きのショーケース型ではありません。そして使用中の分注品を、使う合間に実験台へ出しっぱなしにしないでください。

必要な分だけ温めてください。500 mL のボトルを丸ごと繰り返し 37 °C にすると、グルタミンの加水分解が進み、重炭酸も飛びます。ほとんどの給餌には室温で十分です。

ボトルを開けたあとに淡いピンクがマゼンタ寄りへ濃くなるのは、正常な重炭酸の抜けで、インキュベーターに戻せば元に戻ります。接種していないボトルで濁り、粒子、あるいは黄色への変化が見られたら、それは正常ではありません。廃棄したうえで、培地ではなく自分の濾過操作や無菌操作を確認してください。

RPMI は浮遊細胞専用だと思い込む。 接着系腫瘍細胞株のかなりの部分が、日常的に RPMI で維持されています。

プロジェクトの途中で細胞株を DMEM から RPMI へ（またはその逆へ）乗り換える。 増殖速度、飽和密度、一部の遺伝子の発現が変わります。どうしても切り替えるなら、数継代かけて徐々に馴らし、アッセイの基準値を取り直してください。

初代リンパ球やハイブリドーマの培養で 2-メルカプトエタノールを忘れる。 これが抜けていることは、初代 T 細胞の培養がうまくいかない典型的な原因です。

カルシウムを必要とする細胞に RPMI を使う。 0.42 mM では、一部の上皮系プロトコルが前提としている接合部の形成やカルシウム依存の分化を支えられません。

ATCC 改変品をふつうの RPMI として扱う。 グルコース（4.5 対 2.0 g/L）、ピルビン酸、HEPES が違います。どちらを使ったか記録してください。

グルタミンを加えたのにボトルへ日付を書かない。 グルタミンの分解で生じたアンモニアが蓄積します。リンパ系細胞は、多くの接着系細胞株が耐える濃度より低いところで毒性を受けます。