Terreno RPMI 1640

RPMI 1640 è stato messo a punto da George Moore, Robert Gerner e H. Addison Franklin al Roswell Park Memorial Institute di Buffalo, nello Stato di New York, e pubblicato nel 1967 in un lavoro sulla coltura dei leucociti umani normali. RPMI sono le iniziali dell'istituto; 1640 è il numero della formulazione all'interno di una serie. Nasce come modifica del McCoy's 5A (a sua volta indicato talvolta come RPMI 1630) ed era rivolto a un problema che i terreni derivati da Eagle risolvevano male: far crescere in sospensione le cellule linfoblastoidi.

Quell'origine spiega quasi ogni tratto distintivo del terreno. Le cellule in sospensione non hanno bisogno — anzi sono inibite — dell'elevato tenore di calcio che favorisce l'adesione. I leucociti coltivati per giorni richiedono un sistema tamponante che tenga ai livelli di CO2 di un incubatore standard. E il terreno doveva sostenere cellule esigenti quanto a stato redox: da qui la presenza di glutatione ridotto, componente quasi unico fra i terreni basali classici.

Da allora RPMI 1640 si è rivelato molto più generale di quanto il nome suggerisca. Sostiene bene anche molte linee adese ed è la base standard del pannello tumorale NCI-60, della coltura di ibridomi, del lavoro sulle cellule mononucleate del sangue periferico e della maggior parte delle linee umane di leucemia e di linfoma.

La formulazione standard di RPMI 1640, così come viene fornita da tutti i principali produttori:

Sali inorganici e componenti principali

Amminoacidi (mg/L)

L-arginina 200; L-asparagina 50; acido L-aspartico 20; L-cistina·2HCl 65; acido L-glutammico 20; glicina 10; L-istidina 15; L-idrossiprolina 20; L-isoleucina 50; L-leucina 50; L-lisina·HCl 40; L-metionina 15; L-fenilalanina 15; L-prolina 20; L-serina 30; L-treonina 20; L-triptofano 5; L-tirosina sale disodico diidrato 29; L-valina 20.

Vitamine (mg/L)

i-Inositolo 35; cloruro di colina 3; acido para-amminobenzoico 1; acido folico 1; niacinamide 1; tiamina·HCl 1; D-pantotenato di calcio 0.25; biotina 0.2; riboflavina 0.2; vitamina B12 (cianocobalamina) 0.005.

Quattro voci di questo elenco meritano una sosta, perché sono ciò che rende RPMI RPMI:

• Il calcio è molto basso. 0.42 mM, contro 1.8 mM in DMEM e in MEM. È una scelta deliberata: poco calcio scoraggia l'adesione fra cellule e al substrato che vanificherebbe la coltura in sospensione.
• Il fosfato è molto alto. Circa 5.6 mM dal solo fosfato disodico, all'incirca sei volte quello del DMEM. Ciò conferisce a RPMI una capacità tamponante secondaria apprezzabile oltre a quella del bicarbonato e contribuisce alla sua stabilità nella manipolazione di routine.
• È presente glutatione ridotto a 1 mg/L. Nessun altro terreno basale classico lo include. Aggiunge capacità antiossidante, aspetto rilevante per i leucociti primari.
• Sono presenti biotina, vitamina B12, PABA e idrossiprolina, nessuno dei quali compare in DMEM o in MEM. La copertura vitaminica di RPMI è più ampia di quella dei terreni derivati da Eagle, pur con concentrazioni amminoacidiche molto più basse.

Si noti anche ciò che manca: RPMI non contiene alcuna fonte di ferro né oligoelementi. Li fornisce il siero.

RPMI 1640 contiene 2,000 mg/L di D-glucosio: 2.0 g/L, ovvero 11.1 mM. È il valore della formulazione standard ed è lo stesso presso tutti i fornitori, perché RPMI 1640 è una formulazione standard pubblicata e non proprietaria. Se si confronta la scheda tecnica di un produttore con un protocollo scritto per un altro, il glucosio è 2.0 g/L in tutti, a meno che il nome del prodotto non dica diversamente.

Le eccezioni sono varianti dichiarate in etichetta:

• RPMI 1640 modificato secondo ATCC porta il glucosio a 4,500 mg/L (4.5 g/L, 25 mM) e aggiunge 1 mM di piruvato di sodio e 10 mM di HEPES.
• RPMI 1640 senza glucosio non ne contiene affatto e si impiega negli studi metabolici in cui la fonte di carbonio viene stabilita dall'operatore.
• RPMI 1640 con HEPES mantiene il glucosio a 2.0 g/L e aggiunge il tampone.

A 11.1 mM il glucosio di RPMI è vicino alla glicemia fisiologica e pari a circa la metà di quello del DMEM ad alto glucosio. È un vantaggio reale negli studi metabolici e di immunometabolismo, dove 25 mM di glucosio è una concentrazione farmacologica che sopprime la fosforilazione ossidativa in molti tipi cellulari. È uno svantaggio per le colture molto dense, che lo esauriscono prima e vanno alimentate più spesso.

Il pH di esercizio di RPMI 1640 è 7.2 ± 0.2, misurato sul terreno completo equilibrato al 5% di CO2. Come per ogni terreno tamponato a bicarbonato, una bottiglia misurata fredda al bancone legge un valore più alto perché ha perso CO2 disciolta, e rientra nelle specifiche una volta in incubatore. L'elevato contenuto di fosfato dà a RPMI un tamponamento indipendente dalla CO2 maggiore di quello del DMEM, per cui la deriva durante la manipolazione è più lenta.

Sono i due terreni basali più usati e non sono intercambiabili. Le differenze principali riguardano calcio, fosfato, glucosio, concentrazione amminoacidica e bicarbonato: la tabella di confronto in fondo alla pagina dà il quadro completo a livello di componente, con la conseguenza pratica di ciascuna differenza.

Nella pratica la decisione si riduce quasi sempre a tre domande.

La coltura è in sospensione o adesa? Le cellule linfoidi ed ematopoietiche in sospensione vanno in RPMI. Le linee fibroblastiche ed epiteliali saldamente adese vanno in DMEM. Il poco calcio di RPMI ostacola un'adesione forte; gli 1.8 mM di calcio del DMEM la sostengono.

Che cosa dice il protocollo pubblicato della linea? Per le linee consolidate non è una questione di preferenza. Jurkat, K562, THP-1, Raji, U937, HL-60, MOLT-4, gran parte dei membri del pannello NCI-60 e la maggior parte degli ibridomi hanno RPMI 1640 nei protocolli di riferimento. HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero, COS-7 e C2C12 hanno DMEM. Spostare una linea dall'uno all'altro cambia il tempo di duplicazione, la densità di saturazione e spesso l'espressione proteica, e quindi invalida il confronto con la letteratura se non si ricaratterizza la linea.

Qual è la domanda metabolica? Il DMEM, con 25 mM di glucosio e una concentrazione amminoacidica circa quattro volte quella di RPMI, è costruito per colture dense, rapide, a forte richiesta. RPMI, con 11 mM di glucosio e livelli amminoacidici modesti, è costruito per cellule che crescono a ritmo moderato in sospensione nell'arco di giorni. Spingere una coltura a forte richiesta in RPMI significa alimentarla più spesso.

Esiste un ibrido davvero utile: RPMI 1640 modificato secondo ATCC, che porta il glucosio a 4.5 g/L e aggiunge 1 mM di piruvato di sodio e 10 mM di HEPES. Conserva il carattere ionico di RPMI offrendo però la riserva nutritiva di un terreno ad alto glucosio, ed è una buona opzione per gli ibridomi e per le altre colture che dipendono da RPMI ma crescono ad alta densità.

Linee linfoidi ed ematopoietiche consolidate. Jurkat, K562, HL-60, THP-1, U937, Raji, Ramos, MOLT-4, Daudi e la maggior parte delle linee linfoblastoidi B e T. L'integrazione standard è 10% di FBS e 2 mM di L-glutammina.

Leucociti umani primari. PBMC, linfociti T isolati, linfociti B, monociti e colture di cellule dendritiche. È il caso d'uso per cui RPMI è stato progettato. Nelle colture primarie prolungate il contenuto di glutatione e l'ampia copertura vitaminica sono vantaggi concreti.

Ibridomi e produzione di anticorpi. RPMI 1640, spesso con integrazioni aggiuntive, è la base classica per gli ibridomi. Per la produzione oggi prevalgono i terreni chimicamente definiti, ma RPMI resta lo standard per la fusione e la clonazione.

Molte linee tumorali adese. MCF-7, A549, PC-3, HT-29, SK-MEL e moltissime altre sono mantenute abitualmente in RPMI. Non esiste alcuna regola per cui RPMI serva solo alle cellule in sospensione: il pannello NCI-60 è coltivato in RPMI sia nei membri adesi sia in quelli in sospensione.

Dove RPMI è una scelta poco felice: cellule che richiedono molto calcio per formare giunzioni o per differenziare, processi fed-batch ad altissima densità senza una formulazione modificata, e la crescita clonale a bassa densità senza siero, che richiede una base derivata da F-12 o progettata allo scopo.

I 2,000 mg/L (23.8 mM) di bicarbonato di sodio di RPMI 1640 sono calibrati su un'atmosfera al 5% di CO2, cioè l'impostazione di quasi tutti gli incubatori. È uno dei vantaggi pratici silenziosi di RPMI rispetto al DMEM, i cui 3,700 mg/L di bicarbonato erano formulati per il 10% di CO2 e risultano perciò alcalini al 5%.

L'elevato fosfato di RPMI aggiunge un tampone secondario che lavora indipendentemente dalla CO2, per cui il terreno tollera meglio il tempo passato al bancone rispetto a un terreno con poco fosfato e pari bicarbonato. Perde comunque CO2 e vira verso l'alcalinità se resta aperto: conviene tenere breve il tempo di bottiglia aperta.

Le varianti con HEPES sono fornite a 25 mM (oppure a 10 mM nella modifica ATCC). Si impiegano per la citometria a flusso, per la microscopia su cellule vive, per le sessioni prolungate di separazione cellulare o per qualunque protocollo che tenga le cellule fuori da un'atmosfera con CO2 per più di qualche minuto. Valgono due avvertenze: HEPES genera perossido di idrogeno se esposto alla luce e, a 25 mM, è tossico per alcune cellule primarie. Non va considerato un miglioramento gratuito.

RPMI senza rosso fenolo è disponibile per i saggi in fluorescenza e in assorbanza, per la citometria a flusso in cui il rosso fenolo alza il fondo e per gli studi di risposta ormonale: il rosso fenolo ha una debole attività estrogenica, fattore confondente documentato nelle linee positive al recettore degli estrogeni come MCF-7.

Siero. Il 10% di FBS è lo standard; alcuni protocolli usano il 20% per le colture primarie o a bassa densità e il 5% per le linee ben adattate.

Glutammina. RPMI ne contiene 300 mg/L (circa 2 mM) quando è fornito con glutammina. Poiché la glutammina si degrada in soluzione ad ammoniaca, l'RPMI senza glutammina con aggiunta fresca al momento dell'uso — oppure il dipeptide stabile L-alanil-L-glutammina — dà risultati più costanti, soprattutto nelle colture alimentate una volta a settimana anziché ogni due giorni.

2-Mercaptoetanolo. 50 µM è lo standard per la coltura di linfociti primari, di ibridomi e di linfociti T murini. Favorisce l'assorbimento di cistina e aiuta a mantenere il glutatione intracellulare. Per alcune colture primarie è un requisito reale, non un'aggiunta facoltativa.

Piruvato di sodio e amminoacidi non essenziali. 1 mM di piruvato e NEAA 1x sono aggiunte frequenti, in particolare per i protocolli NCI-60 e per le colture a siero ridotto. RPMI contiene già diversi amminoacidi non essenziali, quindi l'integrazione con NEAA rende qui meno di quanto renda nel DMEM.

RPMI senza glucosio si impiega negli studi metabolici: sostituendo il galattosio per forzare il metabolismo ossidativo, oppure titolando il glucosio a un livello definito. RPMI è una base migliore del DMEM per questo scopo, perché il suo glucosio di partenza è già più vicino a quello fisiologico.

RPMI in polvere è la via economica sulle grandi quantità. Viene fornito senza bicarbonato di sodio, che si aggiunge alla ricostituzione (2.0 g/L); si corregge il pH circa 0.1–0.2 unità sotto il valore obiettivo per compensare l'aumento durante la filtrazione e si sterilizza per filtrazione a 0.22 µm.

L'RPMI 1640 liquido si conserva a 2–8 °C al riparo dalla luce, con una durata di conservazione tipica di 12–24 mesi a confezione integra. Una volta aggiunta la glutammina si conti su circa quattro settimane di vita utile; il terreno integrato con siero, da due a quattro settimane.

L'esposizione alla luce è il problema di conservazione più sottovalutato. Riboflavina, acido folico e triptofano si fotodegradano e, dove è presente HEPES, la reazione genera perossido di idrogeno. Un terreno tenuto su uno scaffale aperto sotto l'illuminazione del laboratorio perde in modo misurabile efficienza di piastramento. Le bottiglie vanno tenute in un frigorifero chiuso, non in un frigorifero a vetrina illuminato, e le aliquote di lavoro non vanno lasciate al bancone fra un impiego e l'altro.

Scaldare solo ciò che serve. Portare ripetutamente a 37 °C un'intera bottiglia da 500 mL accelera l'idrolisi della glutammina e allontana il bicarbonato. Per la maggior parte dei cambi di terreno la temperatura ambiente è sufficiente.

Un lieve viraggio dal rosa al magenta dopo l'apertura della bottiglia è la normale perdita di bicarbonato e si inverte in incubatore. Torbidità, particolato o un viraggio al giallo in una bottiglia non inoculata non sono normali: eliminare il lotto e verificare la filtrazione o la tecnica asettica, non il terreno.

Dare per scontato che RPMI serva solo alle cellule in sospensione. Una quota rilevante delle linee tumorali adese è mantenuta abitualmente in RPMI.

Spostare una linea da DMEM a RPMI (o viceversa) a progetto in corso. Cambiano la velocità di crescita, la densità di saturazione e l'espressione di alcuni geni. Se il passaggio è inevitabile, adattare la linea gradualmente nell'arco di più passaggi e ricalibrare i saggi.

Dimenticare il 2-mercaptoetanolo nella coltura di linfociti primari o di ibridomi. La sua assenza è una causa frequente di rese scarse nelle colture primarie di linfociti T.

Usare RPMI per cellule che hanno bisogno di calcio. A 0.42 mM, RPMI non sostiene la formazione di giunzioni né il differenziamento calcio-dipendente su cui si basano alcuni protocolli epiteliali.

Trattare la modifica ATCC come RPMI semplice. Differisce per glucosio (4.5 contro 2.0 g/L), piruvato e HEPES. Va annotato quale versione si è usata.

Aggiungere la glutammina senza datare la bottiglia. L'ammoniaca prodotta dalla degradazione della glutammina si accumula ed è tossica per le cellule linfoidi a concentrazioni più basse di quelle tollerate da molte linee adese.