Hücre Hattınız İçin DMEM Nasıl Seçilir

Yaygın bir durum: HEK293T (ATCC CRL-3216) rutin pasaj sırasında high-glucose DMEM içinde iyi büyür, ardından sodium pyruvate’ı sessizce kaldıran ve stable glutamine’den free L-glutamine’e geçen bir reaktif değişikliğinden sonra canlılık 92%’den 78%’e düşer.

Bu gizemli bir hücre hattı başarısızlığı değildir. Bu bir formülasyon uyumsuzluğudur.

DMEM seçimi genellikle altı boyutta kararlaştırılır: glucose seviyesi, phenol red, L-glutamine formu, sodium pyruvate, HEPES ve amino asit seti. High glucose, 4.5 g/L, hızlı glikolitik hatları ve yoğun kültürleri destekler. Low glucose, 1.0 g/L, hücreler lactate birikimi, değişmiş morfoloji veya metabolizmaya duyarlı readout’lar gösterdiğinde çoğu zaman daha iyi bir başlangıç noktasıdır.

• Glucose: HEK293T (ATCC CRL-3216), U-2 OS (ATCC HTB-96) ve birçok yüksek yoğunluklu iş akışı için 4.5 g/L. Daha yavaş primer benzeri veya metabolizmaya duyarlı çalışmalar için 1.0 g/L.
• Phenol red: rutin kültür ve görsel pH kayması için koruyun. Floresan görüntüleme, hormona duyarlı assay’ler veya zayıf reporter readout’ları için çıkarın.
• L-glutamine: free L-glutamine gelenekseldir, ancak stable glutamine dipeptide daha uzun beslemeler sırasında ammonia artışını azaltır.
• Sodium pyruvate: oksidatif stres tamponlama ve toparlanma için 1.0 mM’de yararlıdır. Pyruvate metabolik flux assay’lerini etkilediğinde dahil etmeyin.
• HEPES: düşük-CO2 elleçleme, mikroskopi ve 5% CO2 inkübatörü dışındaki taşıma süreleri için 10 ila 25 mM’de yararlıdır.
• Amino asit seti: standard DMEM rutin bakım için uygundur, ATCC modifikasyonu eski hücre bankası protokolleriyle eşleşmeye yardımcı olur ve gelişmiş amino asit setleri daha yüksek yoğunluklu veya strese yatkın kültürleri destekler.

Şekil 1, glucose ve lactate baskısı. High-glucose DMEM 4.5 g/L glucose ile başlar; bu, hızlı büyüyen hücrelere daha fazla karbon rezervi sağlar. Bunun bedeli lactate oluşumudur. Yoğun HEK293T (ATCC CRL-3216) veya HeLa (ATCC CCL-2) kültürlerinde 20 ila 25 mM üzerindeki lactate çoğu zaman daha yavaş büyüme, 7.0 altına pH kayması ve daha erken besiyeri tükenmesiyle aynı zamana denk gelir.

Şekil 2, tampon ve azot kimyası. Bicarbonate tamponlu DMEM, CO2 kontrolü etrafında tasarlanmıştır. HEPES, kabın 30 ila 90 dakika oda havasında kalabileceği tezgâh üstü elleçleme veya canlı hücre görüntüleme sırasında tamponlama kapasitesi ekler. Glutamine kimyası önemlidir çünkü free L-glutamine depolama ve kültür sırasında parçalanırken, stable glutamine 72 ila 120 saatlik çalışmalarda ammonia yükünü azaltabilir.

Pyruvate farklı bir karar noktasında yer alır. Oksidatif stresten toparlanmayı destekleyebilir ve hücrelere ek bir karbon kaynağı sağlar, ancak mitokondriyal fenotipleri de maskeleyebilir. Seahorse tarzı metabolik assay’ler, lactate izleme veya pyruvate-yanıt çalışmaları için pyruvate-free DMEM ile başlayın ve pyruvate’ı kontrollü bir değişken olarak ekleyin.

Temel mantık eskidir, ancak hâlâ yararlıdır. Eagle’ın tanımlı besin çalışması, amino asitlerin, vitaminlerin, tuzların ve glucose’un arka plan bileşenleri yerine aktif deneysel değişkenler olarak ele alınması gerektiğini ortaya koymuştur [1] Eagle H. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501.

DMEM’i yalnızca adına bakarak seçmeyin. Ölçülen lot değerlerini doğrulayın, ardından bunları hücre hattı ve assay ile eşleştirin.

Glucose seçimi için 48 ve 72 saat sonra kullanılmış besiyerini ölçün. Glucose 1.5 g/L üzerinde kalıyor ancak lactate 22 mM’yi aşıyorsa, daha da yüksek besin yoğunluğuna geçmek nadiren yanıttır. Glucose 0.5 g/L altına düşerken canlılık 90% üzerinde kalıyorsa, high-glucose veya beslemeli bir strateji daha savunulabilir.

Bunlar başlangıç noktalarıdır, kalıcı kurallar değildir. Yeni formülasyonda en az iki pasajdan sonra morfolojiyi, ikilenme süresini, kullanılmış ortamdaki glukozu, laktatı ve viabiliteyi yeniden kontrol edin.

Kültür büyüyor ancak analiz stabil değilse, aynı anda yalnızca bir DMEM değişkenini değiştirin. High glucose, phenol red mevcut, serbest L-glutamine ve pyruvate mevcut bir ortamdan boyasız, HEPES tamponlu, pyruvate içermeyen bir ortama tam geçiş, aynı anda dört karıştırıcı faktör oluşturabilir.

• Pyruvate duyarlı hücreler: pyruvate içermeyen DMEM sipariş edin, ardından yalnızca karşılaştırma koluna 0.5 veya 1.0 mM düzeyinde sodium pyruvate ekleyin.
• Boyasız görüntüleme uygulamaları: phenol red içermeyen DMEM seçin ve arka planı tam filtre setinde doğrulayın. Zayıf yeşil raportörler için bu, glukoz seçiminden daha önemli olabilir.
• Low-CO2 inkübasyon veya açık işlem: 10 to 25 mM HEPES kullanın. İnkübatör dışında 60 minutes sonra pH değerini, 7.1 to 7.4 hedefiyle doğrulayın.
• Daha uzun kültür pencereleri: çalışma 72 hours değerini aştığında veya amonyağa duyarlı viabilite kaybı görüldüğünde stabil glutamine kullanın.
• Eski protokoller: takviyeleri ayarlamadan önce ATCC modifikasyonunu veya standart amino asit setini eşleştirin.

Low-glucose DMEM’den high-glucose DMEM’e geçerken iki pasajlı bir adaptasyon yürütün. MRC-5 (ATCC CCL-171) için ani bir ozmotik ve besin değişimi, viabiliteyi değiştirmeden önce morfolojiyi değiştirebilir.

Bir laboratuvar, HEK293T (ATCC CRL-3216) geçici transfeksiyonu ve U-2 OS (ATCC HTB-96) canlı hücre görüntülemesi için tek bir DMEM istiyor. İlk eğilim, büyümeyi desteklediği için phenol red, L-glutamine ve sodium pyruvate içeren high-glucose DMEM kullanmaktır. Bu, görüntüleme için ideal olmayacaktır.

Seçimi iki ortama ayırın. HEK293T çoğaltma ve transfeksiyon için high-glucose DMEM, 4.5 g/L glucose, stable glutamine, phenol red mevcut ve 1.0 mM düzeyinde pyruvate ile başlayın. Serbest bırakma kontrolleri yaklaşık 7.2 pH, 300 to 315 mOsmol/kg civarında ozmolalite, endotoxin ≤0.25 EU/mL ve qPCR ile mycoplasma saptanmadığını göstermelidir.

U-2 OS görüntüleme için phenol red içermeyen high-glucose DMEM seçin, plaka 5% CO2 dışında bekliyorsa 10 to 25 mM HEPES ekleyin ve biyoloji gerektirmedikçe pyruvate kullanmayın. Kalifikasyon çalışmasında 48-hour konfluensi, morfolojiyi ve floresans arka planını karşılaştırın. En az 90% viabiliteyi koruyan ve raportör kanalında daha düşük arka plan veren ortamı kullanmaya devam edin.

Ölçek büyütme veya yoğun kültür için, kullanılmış ortam ölçümü katalog adlandırmasından daha öngörücüdür. CHO ve hybridoma proses literatürü, glucose, glutamine, lactate ve ammonia değerlerinin ayrı onay kutuları olarak seçilmek yerine birlikte dengelenmesi gerektiğini tekrar tekrar göstermektedir [2] Ozturk SS et al. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002.

1. Eagle H. Doku kültüründe bir memeli hücre suşunun spesifik amino asit gereksinimleri. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501
2. Ozturk SS, Palsson BO. Hybridoma hücre kültürünün büyüme, metabolik ve antikor üretim kinetikleri: kesikli reaktörde serum konsantrasyonu, çözünmüş oksijen konsantrasyonu ve ortam pH etkileri. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002
3. Altamirano C, Paredes C, Cairo JJ, Godia F. CHO hücre kültürü ortam formülasyonunun iyileştirilmesi: glucose ve glutamine eşzamanlı ikamesi. Biotechnol Prog 2000;16(1):69-75. doi:10.1021/bp990124j
4. Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, et al. İnsan iPSC türetimi ve kültürü için kimyasal olarak tanımlı koşullar. Stem Cell Reports 2011;1(1):1-12. doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001

HEK293T transfeksiyonu için 4.5 g/L mi yoksa 1.0 g/L glucose DMEM mi seçmeliyim?

Normal DMEM yerine phenol red içermeyen DMEM ne zaman kullanılmalıdır?

İnkübatörüm zaten 5% CO2 ile çalışıyorsa HEPES gerekli mi?

Neden sodium pyruvate içermeyen DMEM sipariş edeyim?