Pożywka RPMI 1640

RPMI 1640 opracowali George Moore, Robert Gerner i H. Addison Franklin w Roswell Park Memorial Institute w Buffalo w stanie Nowy Jork, a formulację opublikowano w 1967 roku w pracy o hodowli prawidłowych leukocytów ludzkich. RPMI to inicjały instytutu, a 1640 — numer formulacji w serii. Punktem wyjścia była modyfikacja McCoy's 5A (nazywanej niekiedy RPMI 1630), a celem — problem, z którym pożywki wywodzące się od Eagle'a radziły sobie słabo: wzrost komórek limfoblastoidalnych w zawiesinie.

To pochodzenie tłumaczy niemal każdą wyróżniającą cechę tej pożywki. Komórki rosnące w zawiesinie nie potrzebują dużego stężenia wapnia sprzyjającego przyleganiu — wręcz są przez nie hamowane. Leukocyty hodowane przez wiele dni wymagają układu buforowego, który utrzymuje pH przy stężeniu CO2 typowego inkubatora. Pożywka musiała też utrzymać komórki wrażliwe na stan redoks, i stąd obecność glutationu zredukowanego, składnika niemal unikalnego wśród klasycznych pożywek podstawowych.

Z czasem okazało się, że RPMI 1640 jest znacznie bardziej uniwersalna, niż sugeruje jej nazwa. Dobrze wspiera wiele linii adherentnych i stanowi standardową bazę dla panelu nowotworowego NCI-60, dla hodowli hybrydom, dla pracy z jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej oraz dla większości ludzkich linii białaczkowych i chłoniakowych.

Standardowa formulacja RPMI 1640, dostarczana przez wszystkich głównych producentów:

Sole nieorganiczne i składniki główne

Aminokwasy (mg/L)

L-arginina 200; L-asparagina 50; kwas L-asparaginowy 20; L-cystyna·2HCl 65; kwas L-glutaminowy 20; glicyna 10; L-histydyna 15; L-hydroksyprolina 20; L-izoleucyna 50; L-leucyna 50; L-lizyna·HCl 40; L-metionina 15; L-fenyloalanina 15; L-prolina 20; L-seryna 30; L-treonina 20; L-tryptofan 5; L-tyrozyna (sól disodowa dwuwodna) 29; L-walina 20.

Witaminy (mg/L)

i-Inozytol 35; chlorek choliny 3; kwas para-aminobenzoesowy 1; kwas foliowy 1; niacynamid 1; tiamina·HCl 1; D-pantotenian wapnia 0.25; biotyna 0.2; ryboflawina 0.2; witamina B12 (cyjanokobalamina) 0.005.

Cztery pozycje z tej listy zasługują na chwilę uwagi, bo to one czynią RPMI RPMI:

• Wapnia jest bardzo mało. 0.42 mM wobec 1.8 mM w DMEM i MEM. Jest to zabieg celowy — niskie stężenie wapnia zniechęca komórki do przylegania do siebie i do podłoża, co inaczej uniemożliwiałoby hodowlę zawiesinową.
• Fosforanów jest bardzo dużo. Około 5.6 mM z samego fosforanu disodowego, mniej więcej sześciokrotnie więcej niż w DMEM. Daje to RPMI realną wtórną pojemność buforową poza wodorowęglanem i zwiększa jej stabilność w codziennej pracy.
• Obecny jest glutation zredukowany w stężeniu 1 mg/L. Żadna inna klasyczna pożywka podstawowa go nie zawiera. Wnosi on zdolność antyoksydacyjną, co ma znaczenie dla pierwotnych leukocytów.
• Obecne są biotyna, witamina B12, PABA i hydroksyprolina, których nie ma ani w DMEM, ani w MEM. Pokrycie witaminowe RPMI jest szersze niż w pożywkach wywodzących się od Eagle'a, mimo znacznie niższych stężeń aminokwasów.

Warto też zauważyć, czego brakuje: RPMI nie zawiera źródła żelaza ani pierwiastków śladowych. Dostarcza ich surowica.

RPMI 1640 zawiera 2,000 mg/L D-glukozy — 2.0 g/L, czyli 11.1 mM. Jest to wartość standardowej formulacji, identyczna u wszystkich dostawców, ponieważ RPMI 1640 to opublikowana formulacja wzorcowa, a nie receptura zastrzeżona. Przy porównywaniu karty produktu jednego producenta z protokołem napisanym dla innego glukoza wynosi 2.0 g/L w każdym z nich, chyba że nazwa produktu mówi inaczej.

Wyjątki są zawsze wyraźnie oznaczone:

• RPMI 1640 zmodyfikowana wg ATCC podnosi glukozę do 4,500 mg/L (4.5 g/L, 25 mM) oraz dodaje 1 mM pirogronianu sodu i 10 mM HEPES.
• RPMI 1640 bez glukozy nie zawiera jej wcale i służy do badań metabolicznych, w których źródło węgla ustala się samodzielnie.
• RPMI 1640 z HEPES utrzymuje glukozę na poziomie 2.0 g/L i dodaje bufor.

Przy 11.1 mM glukoza w RPMI jest zbliżona do fizjologicznego stężenia we krwi i mniej więcej o połowę niższa niż w DMEM o wysokiej zawartości glukozy. To realna przewaga w pracy metabolicznej i immunometabolicznej, gdzie 25 mM to stężenie farmakologiczne, hamujące fosforylację oksydacyjną w wielu typach komórek. Jest to natomiast wada przy hodowlach o dużej gęstości, które wyczerpują glukozę szybciej i wymagają częstszego dokarmiania.

Robocze pH RPMI 1640 wynosi 7.2 ± 0.2, mierzone w pełnej pożywce zrównoważonej w 5% CO2. Jak w każdej pożywce buforowanej wodorowęglanem, butelka mierzona na zimno przy stole laboratoryjnym wskazuje wartość wyższą, bo utraciła rozpuszczony CO2, i wraca do specyfikacji w inkubatorze. Wysoka zawartość fosforanów daje RPMI silniejsze buforowanie niezależne od CO2 niż w DMEM, dzięki czemu pH dryfuje wolniej podczas pracy.

To dwie najczęściej używane pożywki podstawowe i nie są one zamienne. Najważniejsze różnice dotyczą wapnia, fosforanów, glukozy, stężenia aminokwasów i wodorowęglanu — tabela porównawcza na końcu tej strony pokazuje pełny obraz na poziomie składników wraz z praktyczną konsekwencją każdej różnicy.

W praktyce decyzja sprowadza się zwykle do trzech pytań.

Czy hodowla jest zawiesinowa, czy adherentna? Limfoidalne i krwiotwórcze komórki rosnące w zawiesinie trafiają do RPMI. Silnie adherentne linie fibroblastyczne i nabłonkowe — do DMEM. Niskie stężenie wapnia w RPMI działa przeciwko mocnemu przyleganiu; 1.8 mM wapnia w DMEM je wspiera.

Co mówi opublikowany protokół dla danej linii? Dla linii ustalonych nie jest to kwestia gustu. Jurkat, K562, THP-1, Raji, U937, HL-60, MOLT-4, większość członków panelu NCI-60 i większość hybrydom mają w protokołach referencyjnych RPMI 1640. HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero, COS-7 i C2C12 mają DMEM. Przeniesienie linii z jednej pożywki do drugiej zmienia czas podwojenia, gęstość nasycenia, a często także ekspresję białek, więc unieważnia porównania z piśmiennictwem, jeśli nie przeprowadzi się ponownej charakterystyki.

Jakie jest zapotrzebowanie metaboliczne? DMEM z 25 mM glukozy i mniej więcej czterokrotnie wyższym stężeniem aminokwasów niż RPMI jest przeznaczona do gęstych, szybko rosnących hodowli o dużym zapotrzebowaniu. RPMI z 11 mM glukozy i umiarkowanym poziomem aminokwasów jest przeznaczona dla komórek rosnących w zawiesinie w umiarkowanym tempie przez wiele dni. Prowadzenie wymagającej hodowli w RPMI oznacza częstsze dokarmianie.

Istnieje jeden naprawdę użyteczny wariant pośredni: RPMI 1640 zmodyfikowana wg ATCC, w której glukozę podniesiono do 4.5 g/L i dodano 1 mM pirogronianu sodu oraz 10 mM HEPES. Zachowuje ona jonowy charakter RPMI, dając jednocześnie zapas składników odżywczych typowy dla pożywki o wysokiej zawartości glukozy, i jest dobrym wyborem dla hybrydom oraz innych hodowli zależnych od RPMI, które rosną do dużej gęstości.

Ustalone linie limfoidalne i krwiotwórcze. Jurkat, K562, HL-60, THP-1, U937, Raji, Ramos, MOLT-4, Daudi oraz większość linii limfoblastoidalnych B i T. Standardowa suplementacja to 10% FBS i 2 mM L-glutaminy.

Pierwotne leukocyty ludzkie. PBMC, izolowane limfocyty T i B, monocyty oraz hodowle komórek dendrytycznych. To pierwotne przeznaczenie RPMI. W długotrwałych hodowlach pierwotnych zawartość glutationu i szerokie pokrycie witaminowe stanowią realną przewagę.

Hybrydomy i produkcja przeciwciał. RPMI 1640, często z dodatkowymi suplementami, jest klasyczną bazą hybrydomową. W produkcji normą są dziś chemicznie zdefiniowane pożywki hybrydomowe, ale RPMI pozostaje standardem na etapie fuzji i klonowania.

Wiele adherentnych linii nowotworowych. MCF-7, A549, PC-3, HT-29, SK-MEL i bardzo wiele innych utrzymuje się rutynowo w RPMI. Nie ma reguły, według której RPMI nadawałaby się wyłącznie do hodowli zawiesinowych; panel NCI-60 prowadzi się w RPMI zarówno dla członków adherentnych, jak i zawiesinowych.

Kiedy RPMI jest złym wyborem: komórki wymagające dużego stężenia wapnia do tworzenia połączeń międzykomórkowych lub do różnicowania, bardzo gęste hodowle z zasilaniem (fed-batch) bez zmodyfikowanej formulacji oraz wzrost klonalny przy niskiej gęstości bez surowicy, który wymaga bazy wywodzącej się z Ham's F-12 albo zaprojektowanej specjalnie do tego celu.

Zawartość wodorowęglanu sodu w RPMI 1640 — 2,000 mg/L (23.8 mM) — jest dobrana do atmosfery 5% CO2, czyli takiej, jaka jest ustawiona w niemal każdym inkubatorze. To jedna z cichych przewag praktycznych RPMI nad DMEM, w której 3,700 mg/L wodorowęglanu opracowano dla 10% CO2, przez co przy 5% pożywka ta jest zasadowa.

Wysoka zawartość fosforanów daje RPMI dodatkowy bufor działający niezależnie od CO2, więc pożywka lepiej znosi czas spędzony przy stole laboratoryjnym niż pożywka uboga w fosforany o tym samym poziomie wodorowęglanu. Nadal jednak traci CO2 i dryfuje w stronę zasadową, jeśli zostawi się ją otwartą, dlatego czas otwarcia butelki należy skracać do minimum.

Warianty z HEPES dostarczane są w stężeniu 25 mM (lub 10 mM w modyfikacji ATCC). Stosuje się je do cytometrii przepływowej, obrazowania żywych komórek, długich sesji sortowania oraz każdego protokołu, który trzyma komórki poza atmosferą CO2 dłużej niż kilka minut. Obowiązują dwa zastrzeżenia: HEPES wytwarza nadtlenek wodoru pod wpływem światła, a przy 25 mM bywa toksyczny dla części komórek pierwotnych. Nie należy traktować go jako darmowego ulepszenia.

RPMI bez czerwieni fenolowej jest dostępna do oznaczeń fluorescencyjnych i absorbancyjnych, do cytometrii przepływowej, w której czerwień fenolowa podnosi tło, oraz do badań odpowiedzi hormonalnej — czerwień fenolowa wykazuje słabą aktywność estrogenową, co jest udokumentowanym czynnikiem zakłócającym w liniach z ekspresją receptora estrogenowego, takich jak MCF-7.

Surowica. Standardem jest 10% FBS; niektóre protokoły stosują 20% dla hodowli pierwotnych lub o niskiej gęstości, a 5% dla linii dobrze zaadaptowanych.

Glutamina. RPMI zawiera 300 mg/L (około 2 mM), jeśli dostarczana jest z glutaminą. Ponieważ glutamina rozkłada się w roztworze do amoniaku, pożywka bez glutaminy z dodatkiem świeżej glutaminy przed użyciem — albo stabilny dipeptyd L-alanylo-L-glutamina — daje bardziej powtarzalne wyniki, zwłaszcza w hodowlach dokarmianych raz w tygodniu, a nie co dwa dni.

2-Merkaptoetanol. 50 µM to standard w hodowli pierwotnych limfocytów, hybrydom i mysich limfocytów T. Wspiera pobieranie cystyny i pomaga utrzymać wewnątrzkomórkowy glutation. Dla części hodowli pierwotnych jest to rzeczywisty wymóg, a nie dodatek opcjonalny.

Pirogronian sodu i aminokwasy endogenne. 1 mM pirogronianu i 1x NEAA to częste dodatki, szczególnie w protokołach NCI-60 i w hodowlach z obniżoną zawartością surowicy. RPMI zawiera już kilka aminokwasów endogennych, więc dodatek NEAA wnosi tu mniej niż w przypadku DMEM.

RPMI bez glukozy służy do badań metabolicznych — zastępowania glukozy galaktozą, aby wymusić metabolizm oksydacyjny, albo miareczkowania glukozy do zadanego poziomu. RPMI jest do tego lepszą bazą niż DMEM, bo jej wyjściowa zawartość glukozy jest bliższa fizjologicznej.

Sproszkowana RPMI to rozwiązanie ekonomiczne przy dużej skali. Dostarczana jest bez wodorowęglanu sodu, który dodaje się przy rekonstytucji (2.0 g/L), po czym ustawia się pH o około 0.1–0.2 jednostki poniżej wartości docelowej, aby uwzględnić wzrost podczas sączenia, i sterylizuje roztwór przez sączenie na filtrze 0.22 µm.

Płynną pożywkę RPMI 1640 przechowuje się w temperaturze 2–8 °C, chroniąc przed światłem; typowy okres trwałości nieotwartego opakowania to 12–24 miesiące. Po dodaniu glutaminy należy liczyć na około cztery tygodnie pracy; pożywka z surowicą — od dwóch do czterech tygodni.

Ekspozycja na światło to najbardziej niedoceniany problem przechowywania. Ryboflawina, kwas foliowy i tryptofan ulegają fotodegradacji, a tam, gdzie obecny jest HEPES, reakcja generuje nadtlenek wodoru. Pożywka stojąca na otwartej półce w świetle laboratoryjnym mierzalnie traci efektywność wysiewu. Butelki należy trzymać w zamkniętej lodówce, a nie w przeszklonej witrynie chłodniczej, i nie zostawiać alikwotów roboczych przy stole laboratoryjnym między użyciami.

Ogrzewać należy tylko tyle, ile potrzeba. Wielokrotne doprowadzanie pełnej butelki 500 mL do 37 °C przyspiesza hydrolizę glutaminy i wypędza wodorowęglan. Do większości dokarmiania wystarcza temperatura pokojowa.

Lekkie zaróżowienie przechodzące w magentę po otwarciu butelki to normalna utrata wodorowęglanu, która cofa się w inkubatorze. Zmętnienie, cząstki stałe lub zażółcenie w nieszczepionej butelce normalne nie są — taką pożywkę należy odrzucić i sprawdzić raczej sączenie oraz technikę aseptyczną niż samą pożywkę.

Zakładanie, że RPMI nadaje się wyłącznie do komórek zawiesinowych. Duża część adherentnych linii nowotworowych jest w niej rutynowo utrzymywana.

Przenoszenie linii z DMEM do RPMI (lub odwrotnie) w trakcie projektu. Zmienia się tempo wzrostu, gęstość nasycenia i ekspresja części genów. Jeśli zmiana jest konieczna, należy adaptować komórki stopniowo przez kilka pasaży i ponownie ustalić punkt odniesienia dla oznaczeń.

Pominięcie 2-merkaptoetanolu w hodowli pierwotnych limfocytów lub hybrydom. Jego brak jest częstą przyczyną słabych wyników hodowli pierwotnych limfocytów T.

Stosowanie RPMI do komórek wymagających wapnia. Przy 0.42 mM RPMI nie utrzyma tworzenia połączeń międzykomórkowych ani różnicowania zależnego od wapnia, na których opierają się niektóre protokoły nabłonkowe.

Traktowanie modyfikacji ATCC jak zwykłej RPMI. Różni się glukozą (4.5 wobec 2.0 g/L), pirogronianem i HEPES. Należy odnotować, której wersji użyto.

Dodanie glutaminy bez opisania butelki datą. Amoniak z rozpadu glutaminy kumuluje się i jest toksyczny dla komórek limfoidalnych przy niższych stężeniach, niż tolerują je liczne linie adherentne.