Kalsiyum ve Magnezyum İçermeyen DPBS, Fenol Kırmızısı Yok

Bu konu hakkında daha fazlası

• Hücre Kültürü KontaminasyonuHücre kültürü kontaminasyonu altı gruba ayrılır: bakteriler, mayalar, filamentli mantarlar ve küfler, mikoplazma, virüsler ve başka bir hücre hattıyla çapraz kontaminasyon. Bakteri, maya ve mantar kendini bir ila beş gün içinde bulanıklık, pH kayması ya da mikroskopta görülen partiküllerle belli eder; yapılacak şey kültürü atmak ve onların girmesine izin veren aseptik teknik hatasını bulmaktır. Mikoplazma, viral kontaminasyon ve yanlış tanımlanmış hücre hattı ise hiçbir görünür değişiklik yaratmaz; yalnızca test ile saptanır — mikoplazma için PCR veya DNA boyama, kimlik için STR profillemesi. Doğrulanmış her biyolojik kontaminasyonda doğru müdahale aynıdır: etkilenen kültürü atmak, inkübatörü dekontamine etmek ve temiz bir dondurulmuş stoktan yeniden başlamak.
• Hemositometre ile Hücre SayımıHemositometre, üzerine hassas biçimde kazınmış bir ızgara taşıyan kalın bir cam lamdır; üzerine oturtulan lamel tam 0.1 mm derinliğinde bir sayım odacığı oluşturur, böylece bilinen bir hacimdeki hücre süspansiyonu mikroskopta sayılıp derişime çevrilebilir. Memeli hücrelerinde 1 mm2'lik dört köşe karesi sayılır, ortalaması alınır, seyreltme faktörüyle ve 10^4 ile çarpılarak mL başına hücre sayısı bulunur; çünkü her köşe karesi tam olarak 10^-4 mL kapsar. Yüklemeden önce örneğin %0,4 tripan mavisi ile 1:1 karıştırılması, aynı sayımdan bir canlılık yüzdesi de verir: boyayı yalnızca zarı bozulmuş ölü hücreler alır.
• HBSS (Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi)HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Hank'in dengeli tuz çözeltisi), hücreleri yıkamak, doku taşımak, reaktif seyreltmek ve hücreleri büyüme besiyeri dışında kısa süre bekletmek için kullanılan izotonik bir dengeli tuz çözeltisidir. Litrede 8,0 g sodyum klorür, 1,0 g D-glukoz, fosfat ve 350 mg/L sodyum bikarbonat içerir; kalsiyum ve magnezyum içeren (1,26 mM Ca, toplam ~0,9 mM Mg) ya da bunları içermeyen formda sunulur. Bikarbonatının düşük olması, HBSS'in atmosferik CO2 altında veya kapalı kaplarda kullanılmak üzere tasarlandığı, %5 CO2'li inkübatörde uzun süreli kültür için düşünülmediği anlamına gelir.
• ACK liziz tamponuACK (Ammonium-Chloride-Potassium) liziz tamponu, fare dalağı, kemik iliği ve lökosit tabakası gibi lökosit hazırlıklarından eritrositleri uzaklaştırmak için kullanılan izotonik bir amonyum klorür çözeltisidir. Standart bileşimi 150 mM amonyum klorür (8,02 g/L NH4Cl), 10 mM potasyum bikarbonat (1,0 g/L KHCO3) ve 0,1 mM disodyum EDTA'dır; pH 7,2-7,4'e ayarlanır. Eritrositler oda sıcaklığında bir ila beş dakika içinde ozmotik olarak parçalanır, çünkü band 3 anyon değiştiricileri ve yüksek karbonik anhidraz etkinlikleri amonyum klorürü ve suyu hücrenin içine çeker; bu taşıma kapasitesinden yoksun olan lökositler ise ayakta kalır.
• PBS ve DPBS: Fark Nedir, Hangisini Kullanmalı?PBS ve DPBS'nin ikisi de fosfat tamponlu tuz çözeltisidir; aradaki fark işlevde değil, reçetededir. Dulbecco formülasyonu (DPBS) potasyum klorür ekler ve tipik bir PBS'nin kabaca iki katı fosfat taşır (yaklaşık 4 mM'ye karşı yaklaşık 9,5 mM); ayrıca iki sürüm halinde satılır — kalsiyum ve magnezyum içeren ve içermeyen. Uygulamada iki değerlikli katyonların bulunup bulunmaması, şişenin üzerinde PBS mi DPBS mi yazdığından çok daha önemlidir: hücreleri tripsinleme ya da EDTA ile disosiyasyon öncesinde yıkarken kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir çözelti kullanın, çünkü Ca2+ ve Mg2+ tam da koparmak üzere olduğunuz kaderin ve integrin bağlarını destekler; hücrelerin yıkama boyunca yapışık ve bütün kalması gerektiğinde ise kalsiyum ve magnezyum içeren sürümü seçin.
• Yoğunluk Gradyanı Ortamı Olarak İyodiksanolİyodiksanol, yoğunluk gradyanı ortamı olarak kullanılan, iyonik olmayan, suda çözünen iyotlu bir bileşiktir; 1,32 g/mL yoğunluğunda steril %60 (w/v) çözelti olarak sunulur. Belirleyici üstünlüğü, kullanışlı yoğunluk aralığının tamamında izoozmotik olmasıdır — %60'lık çözeltinin ozmolalitesi yaklaşık 290 mOsm/kg'dır — böylece hücreler, organeller, virüsler ve hücre dışı veziküller, sükrozun yol açtığı ozmotik su kaybına veya sezyum klorürün yüksek iyonik şiddetine maruz kalmadan yüksek yoğunlukta bantlanabilir. Laboratuvar ölçeğinde AAV saflaştırmasının standart ortamıdır: %15, %25, %40 ve %60'lık dört basamaklı bir gradyan, genom içeren kapsitleri %40-60 arayüzünde ayırır. Ayrıca hücre ayrımı, organel fraksiyonlaması ve hücre dışı vezikül flotasyonunda yaygın olarak kullanılır.
• DF-1 Tavuk Embriyo Fibroblast HücreleriDF-1 (UMNSAH/DF-1, ATCC CRL-12203), endojen aviyan lökoz virüsü lokuslarından yoksun bir tavuk hattı olan East Lansing Line 0 embriyolarından türetilmiş, kendiliğinden ölümsüzleşmiş bir tavuk embriyo fibroblastı hattıdır. Hiçbir endojen retrovirüs taşımadığı ve viral ya da kimyasal dönüşüm olmaksızın ölümsüzleştiği için, aviyan virolojide, aşı geliştirmede ve rekombinant virüs üretiminde primer tavuk embriyo fibroblastlarının standart sürekli alternatifidir. DF-1 hücreleri yüksek glukozlu DMEM'de %10 fetal sığır serumu ile 37 °C ve %5 CO2 koşullarında kültüre alınır, primer CEF'ten daha hızlı büyür, etkin biçimde transfekte edilir ve aviyan influenza, enfeksiyöz bursal hastalık virüsü, aviyan lökoz ve sarkom virüsleri ile diğer birçok aviyan patojenin replikasyonunu CEF'e eşit ya da ondan yüksek titrelerde destekler.
• Hücrelerin Pasajlanması (Subkültür)Hücrelerin pasajlanması (subkültür), konflüense yaklaşan bir kültürdeki hücrelerin taze besiyeri bulunan yeni kaplara aktarılarak büyümenin sürdürülmesidir. Yapışkan hücreler önce ayrılır — genellikle %0,25 ya da %0,05 Trypsin-EDTA veya enzimatik olmayan bir ayırma reaktifiyle — sonra 1:4 gibi bir bölme oranıyla belirlenen daha düşük yoğunlukta yeniden ekilir; süspansiyon hücreleri ise hiçbir ayırma adımı olmadan taze besiyerine seyreltilir. Sürekli yapışkan hücre hatlarının çoğu %70-80 konflüenste pasajlanır ve bu, normalde haftada iki ya da üç pasaj anlamına gelir.