أوساط زراعة الخلايا لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة
في اليوم 14 من تشغيل CHO fed-batch، يُحكم على الوسط المفيد بالمخرجات المقاسة، لا بصياغة الكتالوج: 3.2-5.8 g/L IgG، وحيوية عند الحصاد أعلى من 82%، واللاكتات محفوظة دون 2.8 g/L بعد ذروة الإنتاج. تغطي صفحة التطبيق هذه أوساط زراعة الخلايا لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عبر قطار البذور، والتلقيح، وإنتاج fed-batch لمدة 12-16 يومًا باستخدام CHO-K1 (ATCC CCL-61)، وCHO-DG44، وCHO-S، وخطوط اندماج hybridoma.
سياق العملية — موضع ملاءمة ذلك في العملية الحيوية
يجب أن تدعم أوساط إنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة مهمتين مختلفتين في العملية نفسها: التوسع السريع عبر قطار البذور، ثم الاستقلاب المضبوط في مزرعة الإنتاج.
بالنسبة إلى عمليات التعليق في CHO-K1 (ATCC CCL-61) وCHO-DG44 وCHO-S، تكون توصيتنا المعتادة وسطاً أساسياً محدد التركيب كيميائياً وخالياً من المكونات الحيوانية، مقترناً بتغذيات مركزة من اليوم 3 حتى اليوم 12. يُفرج عن الوسط الأساسي بقيمة pH قدرها 7.21، ومواصفة 7.00-7.40، وأسمولالية 312 mOsmol/kg، ومواصفة 260-320 mOsmol/kg، وسموم داخلية ≤0.25 EU/mL باختبار ليمولوس الأميبي، وعدم كشف الميكوبلازما بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، واجتياز العقم وفق دستور الأدوية الأمريكي <71>.
تُعالَج خطوط اندماج الهجينومة بطريقة مختلفة. فهي غالباً تتحمل الانتقال إلى الخلو من المصل ببطء أكبر، لذلك نبدأ عادةً بوسط هجينومة خالٍ من المصل مع ما يعادل 2-4 mM من L-glutamine، ثم نخفض انتقال المصل المتبقي خلال تمريرتين.
يتشكل سلوك الدُفعات المغذاة بقوة من خلال تغذية الأحماض الأمينية والغلوكوز. في عمليات CHO، يمكن أن ترفع الأسمولالية المفرطة فوق 380 mOsmol/kg الإنتاجية النوعية في بعض النسائل مع خفض الكثافة الخلوية الحية المتكاملة، لذلك ينبغي ربط اختيار الوسط باستقلاب النسيلة، لا بالكثافة القصوى للخلايا الحية فقط [1] تشانغ إكس وآخرون. الهندسة الحيوية للتقنية الحيوية 2015؛112(7):1418-1429. المعرّف الرقمي:10.1002/bit.25554.
ما يجب أن ينجزه وسط إنتاج mAb (pH، osm، glucose، glutamine، تحمل lactate)
يجب أن يحافظ الوسط على إنتاجية المزرعة بعد تباطؤ طور النمو.
| المعامل | الهدف التشغيلي | سبب الأهمية |
|---|---|---|
| pH عند الإفراج | 7.20-7.30، دُفعة نموذجية 7.21 | يقلل صدمة التلقيح ويدعم pH الإنتاج المضبوط بـ CO2 عند 6.95-7.15 |
| الأسمولالية | 290-330 mOsmol/kg للوسط الأساسي، و<380 mOsmol/kg بعد التغذية | تحمي الحيوية مع السماح بإيصال المغذيات المركزة |
| استراتيجية الغلوكوز | 4.0-6.0 g/L عند التلقيح، و1.0-4.0 g/L أثناء الدُفعات المغذاة | تحد من التجويع وتتجنب تراكم اللاكتات المرتفع |
| مكافئ الغلوتامين | 2-6 mM حسب العملية | يدعم النمو دون دفع الأمونيا فوق 4 mM |
| تحمّل اللاكتات | الحفاظ على <3.0 g/L بعد اليوم 8 | يحسن الحيوية في المرحلة المتأخرة وصفاء الحصاد |
لاختبار الإفراج، تشمل دُفعة إنتاج CHO القياسية الخالية من المصل تعزيز النمو في CHO-K1 (ATCC CCL-61): حيوية 95.8% عند 96 h، و2.7 × 10^6 خلية/mL، وزمن تضاعف 22.4 h في فحص دورق الرج. ويُستخدم فحص موازٍ لخلايا HEK293T (ATCC CRL-3216) المتساهلة في دُفعات مكملات مختارة، مع حيوية 96.3% عند 96 h.
تُظهر دراسات منشورة للدُفعات المغذاة أن توقيت تغذية الغلوكوز والأحماض الأمينية يمكن أن يغيّر عيار الجسم المضاد بأكثر من 30% دون تغيير النسيلة [2] لي إف وآخرون. تقدم التقنية الحيوية 2012؛28(3):682-690. المعرّف الرقمي:10.1002/btpr.1533.
مجموعتنا الموصى بها، مرتبة حسب العيار/الحيوية
لبرنامج جديد لجسم مضاد أحادي النسيلة في CHO، ابدأ أولاً بخيار الحيوية العالية، ثم افحص التغذية ذات الإنتاجية النوعية الأعلى إذا كانت النسيلة تحقق بالفعل كثافة قوية للخلايا الحية.
| الترتيب | مجموعة الوسط الموصى بها | أفضل ملاءمة | النتيجة النموذجية خلال 14 يوماً |
|---|---|---|---|
| 1 | قاعدة CCM CHO-CD للدُفعات المغذاة + تغذية CHO A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61)، CHO-DG44، CHO-S | عيار 4.6-5.8 g/L، حيوية الحصاد 84-91%، كثافة قصوى للخلايا الحية 15-22 × 10^6 خلية/mL، إنتاجية نوعية 28-41 pg/خلية/يوم |
| 2 | وسط CCM CHO ADCF عالي الكثافة + تغذية مركزة | قطار بذور معلق عالي الكثافة وإنتاج | عيار 3.8-5.2 g/L، حيوية الحصاد 82-88%، كثافة قصوى للخلايا الحية 18-26 × 10^6 خلية/mL، إنتاجية نوعية 20-34 pg/خلية/يوم |
| 3 | وسط CCM CHO للانتقال إلى الخلو من المصل | مشاريع خفض المصل والتكيّف المبكر للنسائل | عيار 2.1-3.6 g/L، حيوية الحصاد 78-86%، كثافة قصوى للخلايا الحية 8-14 × 10^6 خلية/mL، إنتاجية نوعية 18-29 pg/خلية/يوم |
| 4 | وسط CCM للهجينومة الخالي من المصل + حزمة مكملات | خطوط اندماج الهجينومة ومزارع فحص الأجسام المضادة | 80-450 mg/L جسم مضاد، حيوية 80-90% عند الحصاد، ثبات التمرير عبر 6 تمريرات |
يعتمد الترتيب أولاً على إنتاجية الدُفعات المغذاة، ثم على حيوية الحصاد. إذا كان فريق المعالجة اللاحقة لديك حساساً لبروتينات الخلية المضيفة أو عبء DNA أو حمل المرشح، فقد لا تكون حالة العيار الأعلى هي حالة التكلفة الأدنى.
في فحصنا التجريبي، وصل نموذج CHO-K1 (ATCC CCL-61) للغلوبولين المناعي G1 إلى 5.4 g/L على المجموعة المصنفة أولاً، مع حيوية 88.6% في اليوم 14 وكثافة قصوى للخلايا الحية 19.7 × 10^6 خلية/mL. وصلت النسيلة نفسها في وسط الانتقال إلى 3.0 g/L، لكنها أعطت تكيّفاً أسهل من مزارع المخزون المحتوية على المصل.
دراسة حالة بأرقام مقاسة
أُجريت دراسة في خزان مقلّب سعة 2 L باستخدام منتج CHO-K1 (ATCC CCL-61) للغلوبولين المناعي G1، لُقّح عند 0.45 × 10^6 خلية/mL في قاعدة CCM CHO-CD للدُفعات المغذاة. استخدمت المزرعة طور نمو عند 37 °C، وتحويلاً في درجة الحرارة إلى 33 °C في اليوم 5، وأكسجيناً مذاباً عند 40%، وإضافات تغذية في الأيام 3 و5 و7 و9 و11.
| اليوم | كثافة الخلايا الحية | الحيوية | الغلوكوز | اللاكتات | عيار الغلوبولين المناعي G |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 خلية/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 خلية/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 خلية/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 خلية/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
كانت الإنتاجية النوعية المحسوبة من اليوم 7 إلى اليوم 14 هي 36 pg/خلية/يوم. بلغت أسمولالية الحصاد 356 mOsmol/kg، وكان pH النهائي قبل التوضيح 7.04.
هذا هو النمط الذي نفضله لتأهيل المشتريات: عدم حدوث انهيار في الغلوكوز، واستهلاك اللاكتات بعد منتصف التشغيل، وحيوية فوق 85% عند الحصاد. وقد ارتبط سلوك تحول اللاكتات المماثل بتحسن إنتاجية الدُفعات المغذاة في مزارع CHO للأجسام المضادة أحادية النسيلة [3] فارهايت جي وآخرون. مجلة التقنية الحيوية 2014؛172:82-94. المعرّف الرقمي:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
ملاحظات الشراء
للفحص المبكر، اطلب زجاجات 500 mL أو 1 L من الوسط الأساسي مع مركزات التغذية المطابقة. ولتأكيد العملية، ينتقل معظم المشترين إلى عبوات 10 L أو 20 L أو 50 L مع شهادة تحليل خاصة بالدُفعة.
- طلب البدء الموصى به: 2 × 1 L من قاعدة CCM CHO-CD للدُفعات المغذاة، و1 × 250 mL من تغذية CHO A، و1 × 250 mL من تغذية CHO B، و1 × 100 mL من مكمل الإنتاجية.
- حزمة الإفراج: pH، والأسمولالية، والسموم الداخلية، والعقم، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للميكوبلازما، والمظهر، وتعزيز النمو.
- شارة صغيرة: شحن مجاني إلى جميع أنحاء العالم
- توصية سلسلة التبريد: 2-8 °C للوسط الأساسي السائل، يُحمى من الضوء، ولا يُجمّد.
اطلب حجز دُفعة إذا كانت حملتك تستخدم أكثر من 100 L من الوسط الأساسي أو إذا كان اختيار النسيلة لا يزال نشطاً. يمكننا حجز دُفعات أساسية وتغذيات مطابقة لمدة 60-120 يوماً، بحسب حجم العبوة وجدول التصنيع.
زمن التوريد النموذجي هو 3-7 أيام عمل لعبوات البحث المتوفرة في المخزون و2-5 أسابيع للعبوات السائبة المهيأة. يمكن أن يشمل الإفراج السائب قراءة إضافية لتعزيز نمو الخلايا مدتها 14 يوماً في CHO-K1 (ATCC CCL-61) عند طلبها قبل التعبئة.
المراجع
[1] تشانغ إكس وآخرون. الهندسة الحيوية للتقنية الحيوية 2015؛112(7):1418-1429. المعرّف الرقمي:10.1002/bit.25554.
[2] لي إف وآخرون. تقدم التقنية الحيوية 2012؛28(3):682-690. المعرّف الرقمي:10.1002/btpr.1533.
[3] فارهايت جي وآخرون. مجلة التقنية الحيوية 2014؛172:82-94. المعرّف الرقمي:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] كيم جيه واي وآخرون. الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2012؛4(4):466-479. المعرّف الرقمي:10.4161/mabs.20432.
