Milieux de culture cellulaire pour la production d’anticorps monoclonaux
Au jour 14 d’une culture CHO en fed-batch, un milieu utile se juge sur la production mesurée, et non sur la formulation du catalogue : 3.2-5.8 g/L d’IgG, une viabilité à la récolte supérieure à 82% et un lactate maintenu sous 2.8 g/L après le pic de production. Cette page d’application couvre les milieux de culture cellulaire pour la production d’anticorps monoclonaux dans le train d’ensemencement, l’inoculation et la production fed-batch de 12-16 jours avec CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S et des lignées de fusion d’hybridomes.
Contexte de procédé — où cela s’intègre dans le bioprocédé
Les milieux de production d’anticorps monoclonaux doivent prendre en charge deux fonctions différentes dans le même procédé : une expansion rapide au cours du train d’ensemencement, puis un métabolisme contrôlé en culture de production.
Pour les procédés en suspension CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44 et CHO-S, notre recommandation habituelle est un milieu basal chimiquement défini, sans composants d’origine animale, associé à des feeds concentrés du jour 3 au jour 12. Le milieu basal est libéré avec pH 7.21, spécification 7.00-7.40, osmolalité 312 mOsmol/kg, spécification 260-320 mOsmol/kg, endotoxine ≤0.25 EU/mL par LAL, mycoplasmes non détectés par qPCR et conformité de stérilité USP <71>.
Les lignées de fusion d’hybridomes sont traitées différemment. Elles tolèrent souvent plus lentement la transition vers un milieu sans sérum ; nous commençons donc généralement avec un milieu sans sérum pour hybridomes plus 2-4 mM d’équivalent L-glutamine, puis nous réduisons le report de sérum sur deux passages.
Le comportement en fed-batch est fortement influencé par l’alimentation en acides aminés et en glucose. Dans les procédés CHO, une osmolalité excessive supérieure à 380 mOsmol/kg peut augmenter la qP chez certains clones tout en réduisant la densité cellulaire viable intégrée ; le choix du milieu doit donc être lié au métabolisme du clone, et pas seulement à la densité cellulaire viable maximale [1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
Ce que les milieux de production de mAb doivent assurer (pH, osm, glucose, glutamine, tolérance au lactate)
Le milieu doit maintenir la productivité de la culture après le ralentissement de la phase de croissance.
| Paramètre | Cible de travail | Pourquoi c’est important |
|---|---|---|
| pH à la libération | 7.20-7.30, lot typique 7.21 | Réduit le choc d’inoculation et soutient un pH de production contrôlé par CO2 de 6.95-7.15 |
| Osmolalité | 290-330 mOsmol/kg basal, <380 mOsmol/kg après feed | Protège la viabilité tout en permettant l’apport concentré de nutriments |
| Stratégie glucose | 4.0-6.0 g/L à l’inoculation, 1.0-4.0 g/L pendant le fed-batch | Limite la privation et évite une forte accumulation de lactate |
| Équivalent glutamine | 2-6 mM dépendant du procédé | Soutient la croissance sans faire monter l’ammoniaque au-dessus de 4 mM |
| Tolérance au lactate | Maintenir <3.0 g/L après le jour 8 | Améliore la viabilité en phase tardive et la clarté de la récolte |
Pour les tests de libération, le lot de production CHO standard sans sérum comprend une promotion de croissance dans CHO-K1 (ATCC CCL-61) : viabilité de 95.8% à 96 h, 2.7 × 10^6 cellules/mL et temps de doublement de 22.4 h lors du criblage en flacon agité. Un contrôle parallèle sur cellules permissives HEK293T (ATCC CRL-3216) est utilisé sur certains lots de suppléments, avec une viabilité de 96.3% à 96 h.
Les études publiées en fed-batch montrent que le calendrier d’alimentation en glucose et en acides aminés peut modifier le titre en anticorps de plus de 30% sans changement de clone [2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
Notre ensemble recommandé, classé par titre/viabilité
Pour un nouveau programme de mAb CHO, commencez par l’option à forte viabilité, puis criblez le feed à qP plus élevée si le clone atteint déjà une forte densité cellulaire viable.
| Rang | Ensemble de milieux recommandé | Meilleure adéquation | Résultat typique à 14 jours |
|---|---|---|---|
| 1 | CCM CHO-CD Fed-Batch Base + CHO Feed A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S | Titre 4.6-5.8 g/L, viabilité à la récolte 84-91%, VCD maximale 15-22 × 10^6 cellules/mL, qP 28-41 pg/cellule/jour |
| 2 | CCM CHO ADCF High-Density Medium + feed concentré | Train d’ensemencement et production en suspension haute densité | Titre 3.8-5.2 g/L, viabilité à la récolte 82-88%, VCD maximale 18-26 × 10^6 cellules/mL, qP 20-34 pg/cellule/jour |
| 3 | CCM CHO Serum-Free Transition Medium | Projets de réduction du sérum et adaptation précoce des clones | Titre 2.1-3.6 g/L, viabilité à la récolte 78-86%, VCD maximale 8-14 × 10^6 cellules/mL, qP 18-29 pg/cellule/jour |
| 4 | CCM Hybridoma SFM + pack de suppléments | Lignées de fusion d’hybridomes et cultures de criblage d’anticorps | 80-450 mg/L d’anticorps, viabilité de 80-90% à la récolte, stabilité au passage sur 6 passages |
Le classement est basé d’abord sur la productivité en fed-batch, puis sur la viabilité à la récolte. Si votre équipe downstream est sensible aux protéines de cellule hôte, à la charge en ADN ou à la charge de filtration, la condition au titre le plus élevé peut ne pas être la condition au coût le plus bas.
Dans notre criblage pilote, un modèle IgG1 CHO-K1 (ATCC CCL-61) a atteint 5.4 g/L avec l’ensemble classé premier, avec 88.6% de viabilité au jour 14 et une VCD maximale de 19.7 × 10^6 cellules/mL. Le même clone dans le milieu de transition a atteint 3.0 g/L, mais a permis une adaptation plus facile à partir de cultures stocks contenant du sérum.
Étude de cas avec valeurs mesurées
Une étude en cuve agitée de 2 L a été réalisée avec un producteur IgG1 CHO-K1 (ATCC CCL-61), inoculé à 0.45 × 10^6 cellules/mL dans CCM CHO-CD Fed-Batch Base. La culture a utilisé une phase de croissance à 37 °C, un changement de température à 33 °C au jour 5, de l’oxygène dissous à 40% et des ajouts de feed aux jours 3, 5, 7, 9 et 11.
| Jour | VCD | Viabilité | Glucose | Lactate | Titre IgG |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 cellules/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 cellules/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 cellules/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 cellules/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
La qP calculée du jour 7 au jour 14 était de 36 pg/cellule/jour. L’osmolalité à la récolte était de 356 mOsmol/kg, et le pH final avant clarification était de 7.04.
C’est le profil que nous privilégions pour la qualification d’approvisionnement : pas d’effondrement du glucose, consommation de lactate après le milieu de culture, et viabilité supérieure à 85% à la récolte. Un comportement similaire de bascule du lactate a été associé à une productivité fed-batch améliorée dans les cultures CHO de mAb [3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
Notes d’approvisionnement
Pour le criblage précoce, demandez des flacons de 500 mL ou 1 L de milieu basal ainsi que les concentrés de feed correspondants. Pour la confirmation du procédé, la plupart des acheteurs passent à des conditionnements de 10 L, 20 L ou 50 L avec un certificat d’analyse spécifique au lot.
- Commande initiale recommandée : 2 × 1 L CCM CHO-CD Fed-Batch Base, 1 × 250 mL CHO Feed A, 1 × 250 mL CHO Feed B et 1 × 100 mL de supplément de productivité.
- Dossier de libération : pH, osmolalité, endotoxine, stérilité, qPCR mycoplasmes, apparence et promotion de croissance.
- Petit badge : LIVRAISON GRATUITE DANS LE MONDE ENTIER
- Recommandation de chaîne du froid : 2-8 °C pour le milieu basal liquide, protéger de la lumière, ne pas congeler.
Demandez une réservation de lot si votre campagne utilise plus de 100 L de milieu basal ou si la sélection clonale est encore active. Nous pouvons réserver des lots basaux et de feed appariés pendant 60-120 jours, selon la taille du conditionnement et le calendrier de fabrication.
Le délai habituel est de 3-7 jours ouvrés pour les conditionnements de recherche en stock et de 2-5 semaines pour les conditionnements vrac configurés. La libération en vrac peut inclure une lecture supplémentaire de promotion de croissance cellulaire sur 14 jours dans CHO-K1 (ATCC CCL-61) lorsqu’elle est demandée avant le remplissage.
Références
[1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
[2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
[3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] Kim JY et al. MAbs 2012;4(4):466-479. doi:10.4161/mabs.20432.
