Terreni per coltura cellulare per la produzione di anticorpi monoclonali
Al giorno 14 di una coltura CHO fed-batch, un terreno utile si valuta in base all'output misurato, non alla formulazione del catalogo: 3.2-5.8 g/L IgG, vitalità alla raccolta superiore a 82% e lattato mantenuto sotto 2.8 g/L dopo il picco di produzione. Questa pagina applicativa tratta i terreni per coltura cellulare per la produzione di anticorpi monoclonali in seed train, inoculo e produzione fed-batch di 12-16 giorni utilizzando CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S e linee di fusione hybridoma.
Contesto di processo — dove si inserisce nel bioprocesso
I terreni per la produzione di anticorpi monoclonali devono supportare due funzioni diverse nello stesso processo: rapida espansione attraverso il seed train, quindi metabolismo controllato nella coltura di produzione.
Per processi in sospensione CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44 e CHO-S, la nostra raccomandazione abituale è un terreno basale chimicamente definito, privo di componenti di origine animale, abbinato a feed concentrati dal giorno 3 al giorno 12. Il terreno basale viene rilasciato con pH 7.21, specifica 7.00-7.40, osmolalità 312 mOsmol/kg, specifica 260-320 mOsmol/kg, endotossina ≤0.25 EU/mL mediante LAL, mycoplasma non rilevato mediante qPCR e conformità alla sterilità USP <71>.
Le linee di fusione hybridoma vengono gestite diversamente. Spesso tollerano più lentamente la transizione serum-free, quindi di solito iniziamo con un terreno serum-free per hybridoma più 2-4 mM equivalente di L-glutamine e poi riduciamo il carryover di siero su due passaggi.
Il comportamento fed-batch è fortemente influenzato dall'alimentazione con aminoacidi e glucosio. Nei processi CHO, un'osmolalità eccessiva sopra 380 mOsmol/kg può aumentare qP in alcuni cloni riducendo al contempo la densità cellulare vitale integrata, quindi la selezione del terreno deve essere collegata al metabolismo del clone, non solo alla densità cellulare vitale di picco [1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
Cosa deve fare un terreno per produzione di mAb (pH, osm, glucosio, glutamine, tolleranza al lattato)
Il terreno deve mantenere la coltura produttiva dopo il rallentamento della fase di crescita.
| Parametro | Target operativo | Perché è importante |
|---|---|---|
| pH al rilascio | 7.20-7.30, lotto tipico 7.21 | Riduce lo shock da inoculo e supporta un pH di produzione controllato da CO2 di 6.95-7.15 |
| Osmolalità | 290-330 mOsmol/kg basale, <380 mOsmol/kg dopo il feed | Protegge la vitalità consentendo al tempo stesso l'apporto di nutrienti concentrati |
| Strategia del glucosio | 4.0-6.0 g/L all'inoculo, 1.0-4.0 g/L durante il fed-batch | Limita la carenza e evita un elevato accumulo di lattato |
| Equivalente di glutamine | 2-6 mM dipendente dal processo | Supporta la crescita senza spingere l'ammoniaca sopra 4 mM |
| Tolleranza al lattato | Mantenere <3.0 g/L dopo il giorno 8 | Migliora la vitalità nelle fasi tardive e la limpidezza della raccolta |
Per i test di rilascio, il lotto standard di produzione CHO serum-free include la promozione della crescita in CHO-K1 (ATCC CCL-61): 95.8% di vitalità a 96 h, 2.7 × 10^6 cells/mL e tempo di raddoppio di 22.4 h nello screening in shake flask. Un controllo parallelo su cellule permissive HEK293T (ATCC CRL-3216) viene utilizzato su lotti selezionati di supplementi, con 96.3% di vitalità a 96 h.
Studi fed-batch pubblicati mostrano che la tempistica del feed di glucosio e aminoacidi può modificare il titolo anticorpale di oltre 30% senza cambio di clone [2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
Il nostro set raccomandato, classificato per titolo/vitalità
Per un nuovo programma CHO mAb, iniziate prima con l'opzione ad alta vitalità, quindi esaminate il feed a qP più elevato se il clone raggiunge già una forte densità cellulare vitale.
| Classifica | Set di terreni raccomandato | Migliore applicazione | Esito tipico a 14 giorni |
|---|---|---|---|
| 1 | CCM CHO-CD Fed-Batch Base + CHO Feed A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S | titolo 4.6-5.8 g/L, vitalità alla raccolta 84-91%, VCD di picco 15-22 × 10^6 cells/mL, qP 28-41 pg/cell/day |
| 2 | CCM CHO ADCF High-Density Medium + feed concentrato | Seed train e produzione in sospensione ad alta densità | titolo 3.8-5.2 g/L, vitalità alla raccolta 82-88%, VCD di picco 18-26 × 10^6 cells/mL, qP 20-34 pg/cell/day |
| 3 | CCM CHO Serum-Free Transition Medium | Progetti di riduzione del siero e adattamento precoce dei cloni | titolo 2.1-3.6 g/L, vitalità alla raccolta 78-86%, VCD di picco 8-14 × 10^6 cells/mL, qP 18-29 pg/cell/day |
| 4 | CCM Hybridoma SFM + pacchetto di supplementi | Linee di fusione hybridoma e colture di screening anticorpale | 80-450 mg/L di anticorpo, 80-90% di vitalità alla raccolta, stabilità di passaggio su 6 passaggi |
La classifica si basa prima sulla produttività fed-batch, poi sulla vitalità alla raccolta. Se il vostro team downstream è sensibile a proteine della cellula ospite, carico di DNA o carico sul filtro, la condizione con il titolo più alto potrebbe non essere quella a costo più basso.
Nel nostro screening pilota, un modello CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1 ha raggiunto 5.4 g/L sul set classificato al primo posto, con 88.6% di vitalità al giorno 14 e VCD di picco di 19.7 × 10^6 cells/mL. Lo stesso clone nel terreno di transizione ha raggiunto 3.0 g/L, ma ha dato un adattamento più facile da colture stock contenenti siero.
Caso di studio con numeri misurati
È stato condotto uno studio in stirred-tank da 2 L con un produttore CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1, inoculato a 0.45 × 10^6 cells/mL in CCM CHO-CD Fed-Batch Base. La coltura ha utilizzato fase di crescita a 37 °C, spostamento di temperatura a 33 °C al giorno 5, ossigeno disciolto al 40% e aggiunte di feed nei giorni 3, 5, 7, 9 e 11.
| Giorno | VCD | Vitalità | Glucosio | Lattato | Titolo IgG |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 cells/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 cells/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 cells/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 cells/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
La qP calcolata dal giorno 7 al giorno 14 era 36 pg/cell/day. L'osmolalità alla raccolta era 356 mOsmol/kg e il pH finale prima della chiarificazione era 7.04.
Questo è il profilo che preferiamo per la qualificazione di approvvigionamento: nessun crollo del glucosio, consumo di lattato dopo metà run e vitalità sopra 85% alla raccolta. Un comportamento simile di shift del lattato è stato associato a una migliore produttività fed-batch nelle colture CHO mAb [3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
Note di approvvigionamento
Per lo screening iniziale, richiedi flaconi da 500 mL o 1 L di terreno basale più concentrati di feed abbinati. Per la conferma del processo, la maggior parte degli acquirenti passa a confezioni da 10 L, 20 L o 50 L con certificato di analisi specifico del lotto.
- Ordine iniziale consigliato: 2 × 1 L CCM CHO-CD Base Fed-Batch, 1 × 250 mL CHO Feed A, 1 × 250 mL CHO Feed B e 1 × 100 mL integratore di produttività.
- Pacchetto di rilascio: pH, osmolalità, endotossine, sterilità, qPCR per micoplasma, aspetto e promozione della crescita.
- Badge piccolo: SPEDIZIONE GRATUITA IN TUTTO IL MONDO
- Raccomandazione per la catena del freddo: 2-8 °C per il terreno basale liquido, proteggere dalla luce, non congelare.
Chiedi una prenotazione del lotto se la tua campagna utilizza più di 100 L di terreno basale o se la selezione dei cloni è ancora attiva. Possiamo riservare lotti abbinati di basale e feed per 60-120 giorni, a seconda della dimensione della confezione e del programma di produzione.
Il tempo di consegna tipico è di 3-7 giorni lavorativi per confezioni da ricerca a magazzino e 2-5 settimane per confezioni sfuse configurate. Il rilascio sfuso può includere un'ulteriore lettura di promozione della crescita cellulare di 14 giorni in CHO-K1 (ATCC CCL-61) se richiesta prima del riempimento.
Riferimenti
[1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
[2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
[3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] Kim JY et al. MAbs 2012;4(4):466-479. doi:10.4161/mabs.20432.
