Môi trường nuôi cấy tế bào cho sản xuất kháng thể đơn dòng
Ở ngày 14 của một quy trình CHO fed-batch, một môi trường hữu ích được đánh giá bằng đầu ra đo được, không phải bằng câu chữ trong catalog: 3.2-5.8 g/L IgG, độ sống khi thu hoạch trên 82%, và lactate được giữ dưới 2.8 g/L sau đỉnh sản xuất. Trang ứng dụng này bao quát môi trường nuôi cấy tế bào cho sản xuất kháng thể đơn dòng trong chuỗi giống, cấy khởi đầu và sản xuất fed-batch 12-16 ngày sử dụng CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S và các dòng dung hợp hybridoma.
Bối cảnh quy trình — vị trí phù hợp trong quy trình sinh học
Môi trường sản xuất kháng thể đơn dòng phải hỗ trợ hai nhiệm vụ khác nhau trong cùng một quy trình: tăng sinh nhanh qua chuỗi giống, sau đó là chuyển hóa có kiểm soát trong nuôi cấy sản xuất.
Đối với các quy trình huyền phù CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44 và CHO-S, khuyến nghị thông thường của chúng tôi là môi trường nền định nghĩa hóa học, không chứa thành phần động vật, kết hợp với các feed cô đặc từ ngày 3 đến ngày 12. Môi trường nền được xuất xưởng với pH 7.21, thông số 7.00-7.40, độ thẩm thấu 312 mOsmol/kg, thông số 260-320 mOsmol/kg, nội độc tố ≤0.25 EU/mL theo LAL, không phát hiện mycoplasma bằng qPCR, và đạt vô trùng USP <71>.
Các dòng dung hợp hybridoma được xử lý khác. Chúng thường dung nạp quá trình chuyển sang không huyết thanh chậm hơn, vì vậy chúng tôi thường bắt đầu bằng môi trường không huyết thanh cho hybridoma cộng với tương đương 2-4 mM L-glutamine rồi giảm lượng huyết thanh mang theo qua hai lần cấy chuyền.
Hành vi fed-batch chịu ảnh hưởng mạnh bởi việc bổ sung amino acid và glucose. Trong các quy trình CHO, độ thẩm thấu quá mức trên 380 mOsmol/kg có thể làm tăng qP ở một số clone trong khi làm giảm mật độ tế bào sống tích hợp, vì vậy việc chọn môi trường nên gắn với chuyển hóa của clone, không chỉ với mật độ tế bào sống cực đại [1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
Môi trường sản xuất mAb cần làm gì (pH, osm, glucose, glutamine, khả năng dung nạp lactate)
Môi trường phải giữ cho nuôi cấy tiếp tục tạo sản phẩm sau khi pha tăng trưởng chậm lại.
| Thông số | Mục tiêu làm việc | Vì sao quan trọng |
|---|---|---|
| pH khi xuất xưởng | 7.20-7.30, lô điển hình 7.21 | Giảm sốc khi cấy khởi đầu và hỗ trợ pH sản xuất được kiểm soát bằng CO2 ở 6.95-7.15 |
| Độ thẩm thấu | 290-330 mOsmol/kg nền, <380 mOsmol/kg sau feed | Bảo vệ độ sống trong khi cho phép cung cấp dinh dưỡng cô đặc |
| Chiến lược glucose | 4.0-6.0 g/L khi cấy khởi đầu, 1.0-4.0 g/L trong fed-batch | Hạn chế thiếu dinh dưỡng và tránh tích lũy lactate cao |
| Tương đương glutamine | 2-6 mM tùy quy trình | Hỗ trợ tăng trưởng mà không đẩy ammonia lên trên 4 mM |
| Khả năng dung nạp lactate | Duy trì <3.0 g/L sau ngày 8 | Cải thiện độ sống giai đoạn muộn và độ trong khi thu hoạch |
Đối với kiểm nghiệm xuất xưởng, lô sản xuất CHO không huyết thanh tiêu chuẩn bao gồm thử nghiệm thúc đẩy tăng trưởng trên CHO-K1 (ATCC CCL-61): độ sống 95.8% tại 96 h, 2.7 × 10^6 cells/mL, và thời gian nhân đôi 22.4 h trong sàng lọc bình lắc. Kiểm tra song song tế bào cho phép HEK293T (ATCC CRL-3216) được dùng trên các lô supplement chọn lọc, với độ sống 96.3% tại 96 h.
Các nghiên cứu fed-batch đã công bố cho thấy thời điểm feed glucose và amino acid có thể làm thay đổi hiệu giá kháng thể hơn 30% mà không cần thay đổi clone [2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
Bộ khuyến nghị của chúng tôi, xếp hạng theo hiệu giá/độ sống
Đối với một chương trình CHO mAb mới, hãy bắt đầu trước với lựa chọn độ sống cao, sau đó sàng lọc feed qP cao hơn nếu clone đã đạt mật độ tế bào sống mạnh.
| Hạng | Bộ môi trường khuyến nghị | Phù hợp nhất | Kết quả điển hình 14 ngày |
|---|---|---|---|
| 1 | CCM CHO-CD Fed-Batch Base + CHO Feed A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S | Hiệu giá 4.6-5.8 g/L, độ sống khi thu hoạch 84-91%, VCD cực đại 15-22 × 10^6 cells/mL, qP 28-41 pg/cell/day |
| 2 | CCM CHO ADCF High-Density Medium + concentrated feed | Chuỗi giống huyền phù mật độ cao và sản xuất | Hiệu giá 3.8-5.2 g/L, độ sống khi thu hoạch 82-88%, VCD cực đại 18-26 × 10^6 cells/mL, qP 20-34 pg/cell/day |
| 3 | CCM CHO Serum-Free Transition Medium | Dự án giảm huyết thanh và thích nghi clone giai đoạn sớm | Hiệu giá 2.1-3.6 g/L, độ sống khi thu hoạch 78-86%, VCD cực đại 8-14 × 10^6 cells/mL, qP 18-29 pg/cell/day |
| 4 | CCM Hybridoma SFM + supplement pack | Các dòng dung hợp hybridoma và nuôi cấy sàng lọc kháng thể | Kháng thể 80-450 mg/L, độ sống 80-90% khi thu hoạch, ổn định cấy chuyền qua 6 lần cấy chuyền |
Việc xếp hạng dựa trước hết trên năng suất fed-batch, sau đó là độ sống khi thu hoạch. Nếu đội ngũ downstream của bạn nhạy cảm với protein tế bào chủ, gánh nặng DNA hoặc tải lọc, điều kiện hiệu giá cao nhất có thể không phải là điều kiện có chi phí thấp nhất.
Trong sàng lọc pilot của chúng tôi, một mô hình CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1 đạt 5.4 g/L trên bộ được xếp hạng đầu tiên, với độ sống 88.6% ở ngày 14 và VCD cực đại 19.7 × 10^6 cells/mL. Cùng clone đó trong môi trường chuyển tiếp đạt 3.0 g/L, nhưng cho khả năng thích nghi dễ hơn từ các stock culture có huyết thanh.
Nghiên cứu tình huống với số liệu đo được
Một nghiên cứu bể khuấy 2 L được thực hiện với một producer CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1, được cấy khởi đầu ở 0.45 × 10^6 cells/mL trong CCM CHO-CD Fed-Batch Base. Nuôi cấy sử dụng pha tăng trưởng 37 °C, chuyển nhiệt độ xuống 33 °C vào ngày 5, oxy hòa tan ở 40%, và bổ sung feed vào các ngày 3, 5, 7, 9 và 11.
| Ngày | VCD | Độ sống | Glucose | Lactate | Hiệu giá IgG |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 cells/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 cells/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 cells/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 cells/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
qP tính toán từ ngày 7 đến ngày 14 là 36 pg/cell/day. Độ thẩm thấu khi thu hoạch là 356 mOsmol/kg, và pH cuối cùng trước khi làm trong là 7.04.
Đây là hồ sơ mà chúng tôi ưu tiên cho thẩm định mua sắm: không có sụt glucose, tiêu thụ lactate sau giữa quy trình, và độ sống trên 85% khi thu hoạch. Hành vi chuyển dịch lactate tương tự đã được liên kết với năng suất fed-batch cải thiện trong nuôi cấy CHO mAb [3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
Ghi chú mua sắm
Đối với sàng lọc ban đầu, hãy yêu cầu chai 500 mL hoặc 1 L môi trường nền cộng với các feed concentrate tương ứng. Đối với xác nhận quy trình, hầu hết người mua chuyển sang gói 10 L, 20 L hoặc 50 L kèm chứng nhận phân tích theo từng lô.
- Đơn hàng khởi đầu khuyến nghị: 2 × 1 L CCM CHO-CD Fed-Batch Base, 1 × 250 mL CHO Feed A, 1 × 250 mL CHO Feed B, và 1 × 100 mL productivity supplement.
- Hồ sơ xuất xưởng: pH, độ thẩm thấu, nội độc tố, vô trùng, mycoplasma qPCR, ngoại quan và thúc đẩy tăng trưởng.
- Nhãn nhỏ: MIỄN PHÍ VẬN CHUYỂN TOÀN CẦU
- Khuyến nghị chuỗi lạnh: 2-8 °C cho môi trường nền dạng lỏng, tránh ánh sáng, không đông lạnh.
Hãy yêu cầu giữ lô nếu chiến dịch của bạn sử dụng hơn 100 L môi trường nền hoặc nếu việc chọn clone vẫn đang hoạt động. Chúng tôi có thể giữ các lô nền và feed đồng bộ trong 60-120 ngày, tùy theo kích thước đóng gói và lịch sản xuất.
Thời gian giao hàng điển hình là 3-7 ngày làm việc đối với các gói nghiên cứu có sẵn trong kho và 2-5 tuần đối với các gói bulk cấu hình theo yêu cầu. Xuất xưởng bulk có thể bao gồm thêm kết quả đọc thúc đẩy tăng trưởng tế bào 14 ngày trong CHO-K1 (ATCC CCL-61) khi được yêu cầu trước khi chiết rót.
Tài liệu tham khảo
[1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
[2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
[3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] Kim JY et al. MAbs 2012;4(4):466-479. doi:10.4161/mabs.20432.
