モノクローナル抗体産生用細胞培養培地
CHOフェドバッチ運転の14日目において、有用な培地はカタログ文言ではなく測定されたアウトプットで判断されます：3.2-5.8 g/L IgG、ハーベスト生存率82%超、および産生ピーク後のlactateを2.8 g/L未満に維持。本アプリケーションページでは、CHO-K1 (ATCC CCL-61)、CHO-DG44、CHO-S、およびハイブリドーマ融合株を用いた、シードトレイン、接種、12-16日のフェドバッチ生産にわたるモノクローナル抗体産生用細胞培養培地を取り上げます。
プロセスの背景 — バイオプロセスのどこに適合するか
モノクローナル抗体生産用培地は、同じ工程内で二つの異なる役割を支える必要があります。すなわち、シードトレインでの迅速な増殖と、その後の生産培養における制御された代謝です。
CHO-K1 (ATCC CCL-61)、CHO-DG44、CHO-S の懸濁工程では、当社の通常の推奨は、化学的に成分定義された動物由来成分不含の基礎培地に、3日目から12日目まで濃縮フィードを組み合わせることです。この基礎培地は、pH 7.21、規格 7.00-7.40、浸透圧 312 mOsmol/kg、規格 260-320 mOsmol/kg、リムルス試験によるエンドトキシン ≤0.25 EU/mL、定量ポリメラーゼ連鎖反応でマイコプラズマ不検出、米国薬局方 <71> 無菌試験合格として出荷判定されます。
ハイブリドーマ融合株は別に扱います。多くの場合、無血清への移行により時間がかかるため、通常はハイブリドーマ無血清培地に 2-4 mM の L-glutamine 相当量を加えて開始し、その後2継代にわたって血清の持ち越しを減らします。
フェドバッチ挙動は、アミノ酸およびグルコースのフィードに強く左右されます。CHO 工程では、380 mOsmol/kg を超える過度の浸透圧が、一部のクローンで細胞当たり生産速度を高める一方、積算生細胞密度を低下させることがあるため、培地選定はピーク生細胞密度だけでなく、クローンの代謝にも結び付けるべきです [1] チャン X ほか。*バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング* 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
mAb産生培地に求められること（pH、osm、glucose、glutamine、lactate耐性）
培地は、増殖期が緩やかになった後も培養の生産性を維持しなければなりません。
| 項目 | 作業目標 | 重要な理由 |
|---|---|---|
| 出荷判定時の pH | 7.20-7.30、典型的ロット 7.21 | 接種時ショックを低減し、CO2 制御下の生産 pH 6.95-7.15 を支えます |
| 浸透圧 | 基礎培地 290-330 mOsmol/kg、フィード後 <380 mOsmol/kg | 濃縮栄養供給を可能にしながら生存率を保護します |
| グルコース戦略 | 接種時 4.0-6.0 g/L、フェドバッチ中 1.0-4.0 g/L | 飢餓を抑え、高い乳酸蓄積を避けます |
| Glutamine 相当量 | 工程依存で 2-6 mM | アンモニアを 4 mM 超へ押し上げることなく増殖を支えます |
| 乳酸耐性 | 8日目以降 <3.0 g/L を維持 | 後期の生存率とハーベスト時の清澄性を改善します |
出荷判定試験では、標準的な CHO 無血清生産ロットに、CHO-K1 (ATCC CCL-61) での増殖促進試験が含まれます。振とうフラスコスクリーニングで、96 h 時点の生存率 95.8%、2.7 × 10^6 細胞/mL、倍加時間 22.4 h です。選択されたサプリメントロットでは、並行して HEK293T (ATCC CRL-3216) 許容細胞確認を用い、96 h 時点の生存率は 96.3% です。
公表されたフェドバッチ研究では、クローンを変更しなくても、グルコースおよびアミノ酸フィードのタイミングによって抗体力価が30%を超えて変動し得ることが示されています [2] リ F ほか。*バイオテクノロジー進歩* 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
当社推奨セット、力価/生存率順ランキング
新しい CHO mAb プログラムでは、まず高生存率の選択肢から開始し、クローンがすでに強い生細胞密度に到達している場合に、より高い細胞当たり生産速度のフィードをスクリーニングします。
| 順位 | 推奨培地セット | 最適な適合対象 | 典型的な14日間の結果 |
|---|---|---|---|
| 1 | CCM CHO-CD フェドバッチ基礎培地 + CHO フィード A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61)、CHO-DG44、CHO-S | 力価 4.6-5.8 g/L、ハーベスト時生存率 84-91%、ピーク生細胞密度 15-22 × 10^6 細胞/mL、細胞当たり生産速度 28-41 pg/cell/day |
| 2 | CCM CHO ADCF 高密度培地 + 濃縮フィード | 高密度懸濁シードトレインおよび生産 | 力価 3.8-5.2 g/L、ハーベスト時生存率 82-88%、ピーク生細胞密度 18-26 × 10^6 細胞/mL、細胞当たり生産速度 20-34 pg/cell/day |
| 3 | CCM CHO 無血清移行培地 | 血清低減プロジェクトおよび初期クローン適応 | 力価 2.1-3.6 g/L、ハーベスト時生存率 78-86%、ピーク生細胞密度 8-14 × 10^6 細胞/mL、細胞当たり生産速度 18-29 pg/cell/day |
| 4 | CCM ハイブリドーマ無血清培地 + サプリメントパック | ハイブリドーマ融合株および抗体スクリーニング培養 | 抗体 80-450 mg/L、ハーベスト時生存率 80-90%、6継代を超える継代安定性 |
順位付けは、まずフェドバッチ生産性、次にハーベスト時生存率に基づいています。下流工程チームが宿主細胞タンパク質、DNA 負荷、またはフィルター負荷に敏感な場合、最高力価条件が必ずしも最低コスト条件とは限りません。
当社のパイロットスクリーニングでは、CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1 モデルが、順位1位のセットで 5.4 g/L に達し、14日目の生存率は 88.6%、ピーク生細胞密度は 19.7 × 10^6 細胞/mL でした。同じクローンを移行培地で培養した場合は 3.0 g/L に達しましたが、血清含有ストック培養からの適応はより容易でした。
測定値を含むケーススタディ
2 L 撹拌槽試験を、CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1 産生株で実施し、CCM CHO-CD フェドバッチ基礎培地に 0.45 × 10^6 細胞/mL で接種しました。培養では、37 °C の増殖期、5日目に 33 °C への温度シフト、溶存酸素 40%、ならびに3、5、7、9、11日目のフィード添加を用いました。
| 日 | 生細胞密度 | 生存率 | グルコース | 乳酸 | IgG 力価 |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 細胞/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 細胞/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 細胞/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 細胞/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
7日目から14日目までの算出された細胞当たり生産速度は 36 pg/cell/day でした。ハーベスト時の浸透圧は 356 mOsmol/kg、清澄化前の最終 pH は 7.04 でした。
これは、当社が調達適格性確認で好むプロファイルです。すなわち、グルコースクラッシュがなく、運転中盤以降に乳酸が消費され、ハーベスト時の生存率が85%を超えることです。同様の乳酸シフト挙動は、CHO mAb 培養におけるフェドバッチ生産性の改善と関連付けられています [3] ヴァールハイト J ほか。*バイオテクノロジー誌* 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
調達メモ
初期スクリーニングでは、基礎培地の 500 mL または 1 L ボトルと、対応するフィード濃縮液を依頼してください。工程確認では、ほとんどの購入者がロット別の分析証明書付きで 10 L、20 L、または 50 L パックへ移行します。
- 推奨開始注文：CCM CHO-CD フェドバッチ基礎培地 2 × 1 L、CHO フィード A 1 × 250 mL、CHO フィード B 1 × 250 mL、および生産性サプリメント 1 × 100 mL。
- 出荷判定書類一式：pH、浸透圧、エンドトキシン、無菌性、マイコプラズマ定量ポリメラーゼ連鎖反応、外観、および増殖促進。
- 小バッジ：全世界送料無料
- コールドチェーン推奨：液体基礎培地は 2-8 °C、遮光、凍結不可。
キャンペーンで 100 L を超える基礎培地を使用する場合、またはクローン選定がまだ進行中の場合は、ロット予約をご依頼ください。パックサイズと製造予定に応じて、適合する基礎培地ロットとフィードロットを60-120日間予約できます。
標準的なリードタイムは、在庫の研究用パックで3-7営業日、構成済みバルクパックで2-5週間です。充填前に依頼された場合、バルク出荷判定には、CHO-K1 (ATCC CCL-61) での追加14日間細胞増殖促進読み取りを含めることができます。
参考文献
[1] チャン X ほか。*バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング* 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
[2] リ F ほか。*バイオテクノロジー進歩* 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
[3] ヴァールハイト J ほか。*バイオテクノロジー誌* 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] キム JY ほか。*モノクローナル抗体* 2012;4(4):466-479. doi:10.4161/mabs.20432.
