Pożywki do hodowli komórkowej do produkcji przeciwciał monoklonalnych
W 14. dniu procesu CHO fed-batch przydatną pożywkę ocenia się na podstawie zmierzonego wyniku, a nie sformułowań katalogowych: 3.2-5.8 g/L IgG, żywotność przy zbiorze powyżej 82% oraz mleczan utrzymany poniżej 2.8 g/L po szczycie produkcji. Ta strona aplikacyjna obejmuje pożywki do hodowli komórkowej do produkcji przeciwciał monoklonalnych w etapach seed train, inokulacji oraz 12-16-dniowej produkcji fed-batch z użyciem CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S oraz linii fuzji hybridoma.
Kontekst procesu — gdzie pasuje to w bioprocesie
Pożywki do produkcji przeciwciał monoklonalnych muszą wspierać dwa różne zadania w tym samym procesie: szybką ekspansję przez seed train, a następnie kontrolowany metabolizm w hodowli produkcyjnej.
Dla procesów zawiesinowych CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44 i CHO-S naszą zwykłą rekomendacją jest chemicznie zdefiniowana pożywka bazowa wolna od składników pochodzenia zwierzęcego, połączona ze skoncentrowanymi pożywkami zasilającymi od dnia 3 do dnia 12. Pożywka bazowa jest zwalniana z pH 7.21, specyfikacją 7.00-7.40, osmolalnością 312 mOsmol/kg, specyfikacją 260-320 mOsmol/kg, endotoksyną ≤0.25 EU/mL metodą LAL, mycoplasma niewykryta metodą qPCR oraz zaliczonym testem jałowości USP <71>.
Linie fuzji hybridoma prowadzi się inaczej. Często wolniej tolerują przejście na warunki serum-free, dlatego zwykle zaczynamy od pożywki serum-free dla hybridoma plus ekwiwalent 2-4 mM L-glutamine, a następnie zmniejszamy przeniesienie surowicy w ciągu dwóch pasaży.
Na zachowanie fed-batch silnie wpływa zasilanie aminokwasami i glukozą. W procesach CHO nadmierna osmolalność powyżej 380 mOsmol/kg może zwiększać qP w niektórych klonach, jednocześnie obniżając zintegrowaną gęstość żywych komórek, dlatego dobór pożywki powinien być powiązany z metabolizmem klonu, a nie wyłącznie ze szczytową gęstością żywych komórek [1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
Co musi zapewniać pożywka do produkcji mAb (pH, osmolalność, glukoza, glutamine, tolerancja mleczanu)
Pożywka musi utrzymać produktywność hodowli po spowolnieniu fazy wzrostu.
| Parametr | Cel roboczy | Dlaczego ma znaczenie |
|---|---|---|
| pH przy zwolnieniu | 7.20-7.30, typowa seria 7.21 | Zmniejsza szok inokulacyjny i wspiera pH produkcyjne kontrolowane CO2 na poziomie 6.95-7.15 |
| Osmolalność | 290-330 mOsmol/kg bazowa, <380 mOsmol/kg po zasileniu | Chroni żywotność, umożliwiając jednocześnie dostarczanie skoncentrowanych składników odżywczych |
| Strategia glukozowa | 4.0-6.0 g/L przy inokulacji, 1.0-4.0 g/L podczas fed-batch | Ogranicza głodzenie i zapobiega dużej akumulacji mleczanu |
| Ekwiwalent glutamine | 2-6 mM zależnie od procesu | Wspiera wzrost bez podnoszenia amoniaku powyżej 4 mM |
| Tolerancja mleczanu | Utrzymać <3.0 g/L po dniu 8 | Poprawia żywotność w późnym etapie i klarowność zbioru |
W badaniach zwolnieniowych standardowa seria produkcyjna CHO serum-free obejmuje promocję wzrostu w CHO-K1 (ATCC CCL-61): 95.8% żywotności po 96 h, 2.7 × 10^6 cells/mL oraz czas podwojenia 22.4 h w przesiewie w kolbie wytrząsanej. Równoległa kontrola na komórkach permisywnych HEK293T (ATCC CRL-3216) jest stosowana dla wybranych serii suplementów, z 96.3% żywotności po 96 h.
Opublikowane badania fed-batch pokazują, że czas podawania glukozy i aminokwasów może przesunąć miano przeciwciała o ponad 30% bez zmiany klonu [2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
Nasz rekomendowany zestaw, uszeregowany według miana/żywotności
Dla nowego programu CHO mAb zacznij od opcji o wysokiej żywotności, a następnie przesiej pożywkę zasilającą o wyższym qP, jeśli klon już osiąga wysoką gęstość żywych komórek.
| Pozycja | Rekomendowany zestaw pożywek | Najlepsze dopasowanie | Typowy wynik po 14 dniach |
|---|---|---|---|
| 1 | CCM CHO-CD Fed-Batch Base + CHO Feed A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S | miano 4.6-5.8 g/L, żywotność przy zbiorze 84-91%, szczytowa VCD 15-22 × 10^6 cells/mL, qP 28-41 pg/cell/day |
| 2 | CCM CHO ADCF High-Density Medium + concentrated feed | Seed train i produkcja w zawiesinie o wysokiej gęstości | miano 3.8-5.2 g/L, żywotność przy zbiorze 82-88%, szczytowa VCD 18-26 × 10^6 cells/mL, qP 20-34 pg/cell/day |
| 3 | CCM CHO Serum-Free Transition Medium | Projekty redukcji surowicy i wczesna adaptacja klonu | miano 2.1-3.6 g/L, żywotność przy zbiorze 78-86%, szczytowa VCD 8-14 × 10^6 cells/mL, qP 18-29 pg/cell/day |
| 4 | CCM Hybridoma SFM + supplement pack | Linie fuzji hybridoma i hodowle do przesiewu przeciwciał | 80-450 mg/L przeciwciała, 80-90% żywotności przy zbiorze, stabilność pasaży przez 6 pasaży |
Ranking opiera się najpierw na produktywności fed-batch, a następnie na żywotności przy zbiorze. Jeśli Twój zespół downstream jest wrażliwy na białka komórek gospodarza, obciążenie DNA lub obciążenie filtrów, warunek o najwyższym mianie może nie być warunkiem o najniższym koszcie.
W naszym przesiewie pilotażowym model CHO-K1 (ATCC CCL-61) IgG1 osiągnął 5.4 g/L na zestawie sklasyfikowanym jako pierwszy, z 88.6% żywotności w dniu 14 i szczytową VCD 19.7 × 10^6 cells/mL. Ten sam klon w pożywce przejściowej osiągnął 3.0 g/L, ale zapewnił łatwiejszą adaptację z hodowli zapasowych zawierających surowicę.
Studium przypadku ze zmierzonymi wartościami
Badanie w mieszanym bioreaktorze zbiornikowym 2 L przeprowadzono z producentem IgG1 CHO-K1 (ATCC CCL-61), inokulowanym przy 0.45 × 10^6 cells/mL w CCM CHO-CD Fed-Batch Base. W hodowli zastosowano fazę wzrostu 37 °C, zmianę temperatury do 33 °C w dniu 5, tlen rozpuszczony na poziomie 40% oraz dodatki pożywki zasilającej w dniach 3, 5, 7, 9 i 11.
| Dzień | VCD | Żywotność | Glukoza | Mleczan | Miano IgG |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 cells/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 cells/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 cells/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 cells/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
Obliczone qP od dnia 7 do dnia 14 wyniosło 36 pg/cell/day. Osmolalność przy zbiorze wynosiła 356 mOsmol/kg, a końcowe pH przed klaryfikacją wynosiło 7.04.
To profil, który preferujemy do kwalifikacji zakupowej: brak załamania glukozy, zużycie mleczanu po środku procesu oraz żywotność powyżej 85% przy zbiorze. Podobne zachowanie zmiany mleczanowej było wiązane z poprawą produktywności fed-batch w hodowlach CHO mAb [3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
Uwagi dotyczące zakupów
Do wczesnego przesiewu zamów butelki 500 mL lub 1 L pożywki bazowej plus dopasowane koncentraty pożywek zasilających. Do potwierdzenia procesu większość kupujących przechodzi na opakowania 10 L, 20 L lub 50 L z certyfikatem analizy specyficznym dla serii.
- Rekomendowane zamówienie początkowe: 2 × 1 L CCM CHO-CD Fed-Batch Base, 1 × 250 mL CHO Feed A, 1 × 250 mL CHO Feed B oraz 1 × 100 mL suplement produktywności.
- Pakiet zwolnieniowy: pH, osmolalność, endotoksyna, jałowość, mycoplasma qPCR, wygląd oraz promocja wzrostu.
- Mała plakietka: DARMOWA WYSYŁKA NA CAŁY ŚWIAT
- Zalecenie dotyczące łańcucha chłodniczego: 2-8 °C dla płynnej pożywki bazowej, chronić przed światłem, nie zamrażać.
Poproś o rezerwację serii, jeśli Twoja kampania zużywa ponad 100 L pożywki bazowej lub jeśli selekcja klonu jest nadal aktywna. Możemy zarezerwować dopasowane serie pożywki bazowej i zasilającej na 60-120 dni, w zależności od wielkości opakowania i harmonogramu produkcji.
Typowy czas realizacji wynosi 3-7 dni roboczych dla magazynowanych opakowań badawczych oraz 2-5 tygodni dla skonfigurowanych opakowań bulk. Zwolnienie bulk może obejmować dodatkowy 14-dniowy odczyt promocji wzrostu komórek w CHO-K1 (ATCC CCL-61), jeśli zostanie zamówiony przed napełnianiem.
Referencje
[1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
[2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
[3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] Kim JY et al. MAbs 2012;4(4):466-479. doi:10.4161/mabs.20432.
