細胞培養技術參考庫
每一種培養基、緩衝液與試劑究竟是什麼——組成、用途，以及與其他選擇之間的差異。為實驗檯前的研究人員而寫，不是為型錄而寫。
Media and formulations
化學成分明確培養基
化學成分明確培養基（CD 培養基）是指配方中每一種成分的化學身分與濃度都明確已知的細胞培養基——不含血清、不含蛋白質水解物，也不含任何組成未經定義的生物萃取物。它仍然可以含有蛋白質，只要那是序列明確、以已知濃度加入的重組蛋白質；這正是「化學成分明確」與「無蛋白質」屬於兩個不同分類、而非同義詞的原因。化學成分明確培養基消除了血清帶來的批次間變異、外源感染因子風險與法規負擔，是 CHO、HEK293 與融合瘤系統進行生物製劑生產的標準選擇。
→RPMI 1640 培養基
RPMI 1640 是一種基礎細胞培養基，1966 年由羅斯威爾帕克紀念研究所為了在懸浮狀態下培養人類白血球而開發。它含有 2,000 mg/L 葡萄糖（11.1 mM）、2,000 mg/L 碳酸氫鈉（23.8 mM，為 5% CO2 環境而設定的緩衝）、異常高的磷酸鹽（約 5.6 mM）、偏低的鈣（約 0.42 mM），以及一組相當特殊的成分——還原型麩胱甘肽、生物素、維生素 B12、對胺基苯甲酸與羥脯胺酸。它是淋巴球、融合瘤，以及多數已適應懸浮培養的造血與淋巴系細胞株的標準培養基，一般搭配 10% 胎牛血清使用。
→α-MEM 與最低必需培養基（MEM）
α-MEM 是在 Eagle 最低必需培養基（MEM）的基礎上，再加入全部非必需胺基酸、丙酮酸鈉、硫辛酸、抗壞血酸、生物素與維生素 B12 的強化配方，並分為含核糖核苷與去氧核糖核苷（含核苷）以及不含核苷兩種版本。它沿用與 MEM 相同的鹽類基礎——2,200 mg/L 碳酸氫鈉搭配 5% CO2 環境、1,000 mg/L 葡萄糖與 1.8 mM 鈣——是間質基質細胞（MSC）、骨髓培養、成骨細胞、CHO-DXB11 與 CHO-DG44 篩選以及許多初代細胞的標準培養基。使用 HAT 或甲胺蝶呤篩選系統時，必須改用不含核苷的版本。
→DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培養基）
DMEM 是把 Eagle 最低必需培養基的胺基酸與維生素濃度提高約四倍而來的基礎細胞培養基。它有高葡萄糖（4,500 mg/L，25 mM）與低葡萄糖（1,000 mg/L，5.6 mM）兩種型式，以 3,700 mg/L 碳酸氫鈉緩衝，必須另外添加血清或定義明確的添加物，並搭配 CO2 環境才能維持生理 pH。DMEM 是 HEK293、HeLa、NIH/3T3、Vero 與貼壁型 CHO 等貼壁細胞株，以及大多數初代纖維母細胞的預設培養基。
→細胞培養基中的酚紅
酚紅（酚磺酞）是加在細胞培養基中的 pH 指示劑，含量大約 5-15 mg/L；在 pH 約 6.8 以下轉為黃色，在 pH 約 8.2 以上轉為粉紅到桃紅色，而健康培養基那種正常的橙紅色則落在 pH 7.4 附近。培養基變黃代表酸化，幾乎都是細胞代謝產生的乳酸，來自過度生長的培養或細菌汙染；培養基變粉紅或變紫則代表培養基轉為鹼性，原因幾乎都是 CO2 從碳酸氫鹽緩衝系統中逸失。酚紅本身沒有任何緩衝能力，純粹是診斷用的指標；螢光與吸光度分析，以及雌激素反應性細胞的實驗，都應改用無酚紅培養基，因為這個染料會干擾判讀。
→Reagents and buffers
細胞培養中的 HEPES 緩衝液
HEPES（4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸）是一種兩性離子有機緩衝液，用於細胞培養中，不必依賴培養箱 CO2 就能把培養基維持在生理 pH。它的 pKa 在 20-25 °C 約為 7.5、在 37 °C 約為 7.3，有效緩衝範圍大致涵蓋 pH 6.8-8.2，一般由無菌 1 M 儲備液以 10-25 mM 加入培養基。由於 HEPES 的緩衝作用不依賴碳酸／碳酸氫鹽平衡，添加 HEPES 的培養基在培養瓶離開 5% CO2 培養箱時，能抵抗快速的鹼性漂移。
→HBSS（漢克氏平衡鹽溶液）
HBSS（漢克氏平衡鹽溶液）是一種等滲透壓的平衡鹽溶液，用於清洗細胞、運送組織、稀釋試劑，以及讓細胞離開生長培養基後短時間暫存。它含有 8.0 g/L 氯化鈉、1.0 g/L D-葡萄糖、磷酸鹽與 350 mg/L 碳酸氫鈉，並分為含鈣與鎂（鈣 1.26 mM、鎂總量約 0.9 mM）以及不含鈣與鎂兩種版本。由於碳酸氫鹽含量偏低，HBSS 是設計給大氣 CO2 環境或密閉容器使用，並不適合在 5% CO2 培養箱中長時間培養。
→台盼藍與染料排除存活率分析
台盼藍是一種偶氮染料，以 0.4%（w/v）的濃度用染料排除的原理區分活細胞與死細胞：完整的細胞膜會把帶電的染料擋在外面，所以存活的細胞保持透亮且具折光性，而細胞膜受損的細胞會吸入染料而染成藍色。實務上是把細胞懸浮液與 0.4% 台盼藍以 1:1 混合，加入血球計數盤或自動細胞計數儀，並在 3-5 分鐘內完成計數，同時得到細胞濃度與存活率百分比。由於它只反映細胞膜完整性，台盼藍算的是「已經死掉」的細胞——它偵測不到細胞膜仍然完整、但已經凋亡或代謝失能的細胞，因此讀值會比代謝型或流式細胞儀存活率分析來得高。
→ACK 溶血緩衝液
ACK（Ammonium-Chloride-Potassium）溶血緩衝液是一種等張的氯化銨溶液，用來從白血球製備物中去除紅血球，常見樣本包括小鼠脾臟、骨髓與白血球層。標準配方為 150 mM 氯化銨（8.02 g/L NH4Cl）、10 mM 碳酸氫鉀（1.0 g/L KHCO3）與 0.1 mM EDTA 二鈉鹽，並調整至 pH 7.2-7.4。紅血球在室溫下一到五分鐘內即因滲透作用而破裂，原因是紅血球的帶 3 陰離子交換蛋白與極高的碳酸酐酶活性會把氯化銨與水持續帶進細胞內；白血球缺乏這樣的運輸能力，因此得以存活。
→Trypsin-EDTA
Trypsin-EDTA 是一種細胞解離試劑，結合了絲胺酸蛋白酶胰蛋白酶與螯合劑 EDTA：胰蛋白酶會在細胞表面蛋白與基質蛋白的離胺酸、精胺酸殘基的 C 端側切斷胜肽鍵，EDTA 則結合細胞黏附分子所需的鈣離子與鎂離子。它配製於不含鈣與鎂的平衡鹽溶液中，最常見的規格是供一般細胞株繼代培養使用的 0.05% 胰蛋白酶（0.5 g/L），以及供貼附牢固的細胞與初代培養使用的 0.25%（2.5 g/L）。典型用法是在 37 °C 下作用 2-5 分鐘，之後立即以含血清培養基或明確定義的胰蛋白酶抑制劑終止反應。
→Protocols and methods
用血球計數盤計數細胞
血球計數盤是一片刻有精密格線的厚玻璃載片，蓋上專用蓋玻片後會形成一個深度恰好 0.1 mm 的計數室，因此可以在顯微鏡下數出一個已知體積內的細胞數，再換算成濃度。哺乳動物細胞的做法是數四個 1 mm2 的角落大格、取平均值，乘以稀釋倍數，再乘以 10^4，即得到每毫升細胞數——因為每個角落大格所涵蓋的體積正好是 10^-4 mL。加樣前先把樣品與 0.4% 錐蟲藍以 1:1 混合，同一次計數就能同時得到存活率，因為只有膜完整性受損的死細胞會吸入染劑。
→胎牛血清（FBS）的熱去活化
胎牛血清的熱去活化，是在血清加入培養基之前，先在 56 °C 下進行 30 分鐘受控加溫，把補體級聯系統中不耐熱的蛋白質破壞掉。標準做法是：先把血清解凍，回溫到 37 °C，再移入 56 °C 水浴，從血清本身真正達到溫度的那一刻起計時整整 30 分鐘，其間每 5-10 分鐘輕輕搖晃一次，時間到立刻冷卻並分裝。對於已建立細胞株的例行培養，這個步驟通常並不必要——胎牛血清本身的補體活性就很低，而加熱同時也會破壞不耐熱的生長因子；但在免疫學分析與對補體敏感的細胞上，它仍然是標準做法。
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