DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培養基）

DMEM 最早由 Dulbecco 與 Freeman 於 1959 年提出，是為了多瘤病毒的噬斑分析，而對 Eagle 的 MEM 培養基所做的改良。改動刻意做得很簡單：拿 Eagle 的配方，用上「四倍濃度的胺基酸與維生素」。Eagle 自己的最低必需培養基（MEM）同年發表，已經確立哺乳動物細胞在培養中所需的最小營養組合——13 種必需胺基酸、8 種維生素、葡萄糖，以及 Earle 平衡鹽溶液的六種無機鹽。

把濃度拉高之所以重要，是因為 Eagle 的 MEM 在設計上就是要最低限度。培養物很快就把養分耗盡，必須頻繁換液。把胺基酸與維生素提高為四倍，得到的培養基能在兩次餵食之間支持更高的細胞密度——這正是一位病毒學家連續數天計算噬斑時所需要的。

現在市售的 DMEM 並不是每個成分都剛好等於 MEM 的 4 倍。供應商加入了甘胺酸、絲胺酸與硝酸鐵，並調整了鹽類平衡：碳酸氫鈉從 2,200 提高到 3,700 mg/L，氯化鈉則從 6,800 降到 6,400 mg/L 以維持滲透壓平衡。今天以「DMEM」名義販售的培養基是一個穩定、特性清楚的標準品，但它是商業標準，而不是 1959 年那份原始配方。

這是細胞培養中最常用的兩種基礎培養基，該用哪一種的問題也不斷出現。它們並不能互換，而且差別是結構性的，不是表面上的。

這個決定通常可以化約成三個問題。

這個培養是貼壁還是懸浮？ DMEM 的 1.8 mM 鈣支持牢固貼附；RPMI 的 0.42 mM 則是刻意壓低，好讓類淋巴母細胞維持懸浮。貼壁的纖維母細胞與上皮細胞株用 DMEM；懸浮的淋巴系與造血系細胞用 RPMI。

這株細胞的參考流程怎麼寫？ 對已建立的細胞株而言，這不是偏好問題。把一株細胞在 DMEM 與 RPMI 之間換來換去，會改變倍增時間、飽和密度，往往還會改變蛋白質表現，除非事後重新完整鑑定，否則與已發表文獻的比較就不成立。

這個培養的代謝需求有多高？ DMEM 有 25 mM 葡萄糖，胺基酸濃度也大約是 RPMI 的四倍，是為又密、又快、需求又高的培養而建。RPMI 則是為在數天之內以中等速度生長的細胞而建，高密度培養會較快把它耗盡。

兩者並沒有誰單純比較豐富。DMEM 在胺基酸與葡萄糖上勝出；RPMI 則在維生素、磷酸鹽緩衝，以及它少見的還原型穀胱甘肽含量上勝出。

下表是標準高葡萄糖 DMEM 配方（各大供應商共用的參考配方，對應 Gibco 11965 與 Sigma D5796 一類的產品）。低葡萄糖 DMEM 除了 D-葡萄糖為 1,000 mg/L 而非 4,500 mg/L 之外完全相同。

無機鹽與主要成分

胺基酸（mg/L）

甘胺酸 30；L-精胺酸·HCl 84；L-胱胺酸·2HCl 63；L-組胺酸·HCl·H2O 42；L-異白胺酸 105；L-白胺酸 105；L-離胺酸·HCl 146；L-甲硫胺酸 30；L-苯丙胺酸 66；L-絲胺酸 42；L-蘇胺酸 95；L-色胺酸 16；L-酪胺酸二鈉鹽二水合物 104；L-纈胺酸 94。

維生素（mg/L）

氯化膽鹼 4；D-泛酸鈣 4；葉酸 4；菸鹼醯胺 4；吡哆醇·HCl 4；硫胺·HCl 4；肌醇 7.2；核黃素 0.4。

請注意沒有的東西。除了甘胺酸與絲胺酸之外，DMEM 不含任何非必需胺基酸——沒有丙胺酸、天門冬醯胺、天門冬胺酸、麩胺酸或脯胺酸。它不含核苷、不含生物素、不含維生素 B12，也不含硫辛酸。唯一的微量金屬只有象徵性的一點硝酸鐵。細胞需要的其他一切，都預期由血清供應。這是關於 DMEM 最重要的一項結構性事實：它是一個胺基酸與維生素濃度很高的基礎配方，而其設計前提是血清會補上脂質、微量元素、載體蛋白與生長因子。

這兩種葡萄糖濃度不是可以互換的預設值，憑習慣挑一個是資料無法重現的常見來源。

高葡萄糖（4,500 mg/L，25 mM） 約為生理血糖的五倍。適合快速生長的轉型細胞株、HEK293 的暫時性轉染與病毒生產、融合瘤，以及任何你打算不常餵食就衝到高密度的培養。多出來的葡萄糖等於一個養分儲備庫。代價是：細胞在 25 mM 葡萄糖下會大幅倚賴糖解作用，透過乳酸累積讓培養基更快酸化，並可能表現出糖解型表型——那是培養基造成的假象，而不是你要研究的生物學。

低葡萄糖（1,000 mg/L，5.6 mM） 接近正常人體血糖。適合初代肝細胞、高葡萄糖對分化已有明確影響紀錄的間質基質細胞、長期或分化培養，以及任何你不希望糖解作用全速運轉的代謝研究。當你要比較氧化代謝與糖解代謝時，低葡萄糖 DMEM 也是比較恰當的選擇，因為 25 mM 葡萄糖會透過 Crabtree 效應抑制許多轉型細胞株的氧化磷酸化。

不含葡萄糖的 DMEM 之所以存在也是同樣道理：它讓你自己決定碳源，改用半乳糖來強迫細胞走氧化代謝（粒線體毒性篩檢的標準作法），或把葡萄糖滴定到指定濃度。

如果要把既有培養從一種葡萄糖濃度換到另一種，請逐步進行並重新建立生長曲線。倍增時間、繼代時的匯合度與轉染效率都會改變。

訂購 DMEM 時的混亂，大多來自供應商可以自由組合的四個獨立選項。

麩醯胺酸。 4 mM L-麩醯胺酸是標準值，但它在溶液中會分解——環化成焦麩胺酸並釋出氨，在 4 °C 下半衰期為數週，37 °C 下短得多。不含麩醯胺酸的 DMEM 讓你在使用時才新鮮加入，或改用雙胜肽型式（L-丙胺醯-L-麩醯胺酸）；後者在溶液中穩定，會隨細胞分解而緩慢釋出麩醯胺酸。任何培養超過一週而不做完整換液的情況，雙胜肽都是比較好的工程選擇。

丙酮酸鈉。 在 1 mM 濃度下，丙酮酸提供額外的能量基質與少量抗氧化效益。對低密度或低血清的細胞確實有用，可以改善接種效率。如果你在做代謝通量研究，就不要加——未標記的丙酮酸池會讓同位素追蹤的判讀變複雜。

酚紅。 濃度 15 mg/L 的 pH 指示劑，不是養分。當它干擾你的偵測時就要拿掉——例如 550–600 nm 區間的螢光與吸光度分析、流式細胞術——而且要記得酚紅具有微弱的雌激素活性，這對 MCF-7 這類荷爾蒙反應性細胞株很重要。

HEPES。 通常為 10–25 mM，用來在培養箱外操作時穩定 pH。HEPES 在 pH 7.2–7.4 附近緩衝良好，而且不依賴 CO2。但取捨是真實的：HEPES 在光照下具光毒性，會產生過氧化氫，在 25 mM 濃度下對部分初代細胞與幹細胞培養具細胞毒性。請在流程確實需要長時間離開培養箱時才使用，而不是當成預設值。

DMEM/F-12 是 DMEM 與 Ham's F-12 的 1:1 混合物，對任何想往低血清方向走的人來說，它是 DMEM 家族裡最有用的東西。

Ham's F-12 由 Richard Ham 在 1965 年發表，設計目的是供單株生長使用的化學定義培養基，營養特性正好與 DMEM 相反：胺基酸濃度平平，但含有一整套 DMEM 缺少的成分——微量元素（鋅、銅、以硫酸亞鐵型式提供的鐵）、脂質前驅物（亞麻油酸、硫辛酸、腐胺）、核苷前驅物（次黃嘌呤、胸苷）以及額外的維生素（生物素、B12）。把兩者混合，就得到一個兼具 DMEM 養分濃度與 F-12 廣度的基礎培養基。

標準 DMEM/F-12 配方含 3,151 mg/L 葡萄糖（17.5 mM）、2,438 mg/L 碳酸氫鈉（29 mM）、116.6 mg/L 氯化鈣、55 mg/L 丙酮酸鈉（0.5 mM）、365 mg/L L-麩醯胺酸（2.5 mM）與 8.1 mg/L 酚紅，另外還有 F-12 的微量元素，濃度為其在 F-12 中的一半。廣泛使用的 HEPES 版本改為含 15 mM HEPES，並把碳酸氫鈉降到約 1,200 mg/L。

DMEM/F-12 是無血清與低血清配方的標準基礎，也用於角質細胞與上皮細胞培養、神經幹細胞（搭配 N-2 或 B-27 添加物），以及融合瘤與 iPSC 研究。如果你想降低一個以 DMEM 為基礎的製程中的血清用量，把基礎換成 DMEM/F-12 通常是最有效的第一步，因為血清原本默默供應的微量元素與脂質前驅物，培養基裡本來就有了。

DMEM 的工作 pH 是 7.2 ± 0.2，這是這個培養基的標準規格，也是多數哺乳動物細胞培養所處的範圍。這個數值指的是完整培養基在其設定的 CO2 環境中達到平衡後的狀態——只有在這個條件下，數字才有意義。

DMEM 由碳酸氫鹽／CO2 系統緩衝。溶解的 CO2 形成碳酸，解離為碳酸氫根與質子；pH 由碳酸氫鹽濃度與 CO2 分壓的比值決定。結果就是：培養基裡的碳酸氫鹽濃度與培養箱裡的 CO2 濃度是必須配對的一組參數。

這也是為什麼直接量一瓶剛從冰箱拿出來的培養基，幾乎說明不了什麼。離開 CO2 環境之後，培養基會流失溶解的 CO2 而讀到偏鹼——常常是 7.6 以上——放回培養箱一到兩小時內就會回到規格內。如果你需要有意義的讀值，請先取一份分裝、鬆開瓶蓋放在培養箱中平衡，或改用 pH 完全不依賴 CO2 的 HEPES 緩衝配方。

DMEM 的 3,700 mg/L（44 mM）碳酸氫鹽是為 10% CO2 配的，不是 5%。 這是關於這個培養基最常被忽略的事實。在 5% CO2 下碳酸氫鹽過量，培養基偏鹼，剛放進培養箱時 pH 典型落在 7.6–7.8，看起來是明顯的粉紅到紫色。多數實驗室還是在 5% CO2 下用 DMEM，而且沒出事，因為代謝中的細胞會產生乳酸與 CO2，幾小時內把 pH 拉回來。但剛接種、密度很低的培養瓶沒有這種自我修正，接種效率就會受損。如果你在 5% CO2 下培養而且看到培養基持續呈紫色，就改用 10% CO2、選用碳酸氫鹽較低的配方，或加入 HEPES。

反過來的問題——培養基變黃——就是單純的酸化。酚紅在大約 pH 6.8 以下呈黃色。過度生長、高葡萄糖驅動的乳酸生成、CO2 供應洩漏或用完、細菌汙染，都會造成這個現象。昨天才接種、在顯微鏡下看起來還很稀疏的培養瓶卻已經變黃，比起代謝更可能是汙染。

因為只要瓶子在大氣壓下敞開，碳酸氫鹽就會以 CO2 形式散失，所以放在實驗檯上的培養基會慢慢偏鹼。這是正常現象，放回培養箱就會回復。它是縮短開瓶時間的理由，不是丟棄整瓶的理由。

DMEM 是貼壁、貼附依賴型細胞的標準基礎：HEK293 及其衍生株、HeLa、NIH/3T3 與其他纖維母細胞株、COS-7、Vero、MDCK、C2C12 肌母細胞、初代纖維母細胞、平滑肌細胞與內皮細胞（通常需要額外添加物），以及貼壁型 CHO。典型血清添加量為 10% 胎牛血清，較耐操的細胞株則用 5–10% 新生小牛血清。

DMEM 的高鈣（1.8 mM）是實實在在的選擇標準，不是註腳。這個濃度的鈣會促進鈣黏蛋白介導的細胞間黏附，並驅動角質細胞分化；因此角質細胞與部分上皮細胞流程會改用低鈣的基礎培養基。反過來說，需要牢固貼附的細胞在 DMEM 中會比在 RPMI 中表現更好，後者的鈣只有約 0.4 mM。

對懸浮的淋巴系培養來說，DMEM 是不好的第一選擇——多數人類白血病與淋巴瘤細胞株、PBMC、低密度的融合瘤，慣例上都以 RPMI 1640 為基礎。它同樣不是在無血清、極低密度下做單株生長的培養基，那是 Ham's F-12 與 DMEM/F-12 設計的用途。

血清。 10% FBS 是標準。熱去活化（56 °C、30 分鐘）在對補體敏感的實驗中是慣例，但並非普遍必要，而且會破壞部分生長因子；請有意識地決定，而不是照習慣做。

常見添加物。 任何降低血清的 DMEM 培養都值得補上 1x 非必需胺基酸（100x 儲備液），因為 DMEM 自身的非必需胺基酸只有甘胺酸與絲胺酸。若配方原本不含丙酮酸鈉，可補到 1 mM。青黴素／鏈黴素只在真正需要時使用——常規使用抗生素會掩蓋低量汙染，也會改變黴漿菌的風險樣態。

保存。 液態 DMEM 於 2–8 °C 避光保存，通常可維持標示的保存期限（常見為未開封 12–24 個月）。一旦加入麩醯胺酸，就要把它當成在 2–8 °C 下只剩約四週的有效期。核黃素、葉酸、色胺酸與 HEPES 都對光敏感；把培養基放在實驗室燈光下會產生過氧化氫與降解產物，降低接種效率。瓶子請存放在暗處，不要放在開放層架上。

回溫。 只回溫你要用的那一份。反覆把一整瓶 500 mL 加熱到 37 °C，會加速麩醯胺酸分解與碳酸氫鹽散失。多數操作回溫到室溫就夠了；培養基不必先到 37 °C 才能加到細胞上。

粉末型 DMEM 在大規模時是划算的選擇，但出貨時不含碳酸氫鈉，必須在復溶時加入（標準配方為 3.7 g/L），把 pH 調到比目標值低約 0.1–0.2 個單位以預留過濾過程中的回升，再以 0.22 µm 過濾除菌。用水的電阻率至少要 18.2 MΩ·cm，且內毒素要低。

因為 DMEM 以酚紅緩衝而且是透明的，它比多數試劑更能自己回報狀況。學會讀它，可以救下整台培養箱。

細菌汙染。 培養基會迅速變黃——常常一夜之間——並出現肉眼可見的混濁。在顯微鏡下，細胞之間可以看到會動或會反光的小顆粒，密度更高時會呈現閃爍般的顆粒感。最具診斷價值的組合是又黃、又濁，而且培養本身很稀疏或才剛接種：光靠代謝，細胞那麼少的培養瓶不可能把培養基酸化到那個程度。

酵母菌汙染。 混濁並帶有可見的卵圓形出芽顆粒，pH 下降通常比細菌慢，而且常呈現為分散的團塊，而不是均勻的雲霧狀。

真菌或黴菌汙染。 可見絲狀結構，有時肉眼就能看到毛絨狀的漂浮菌落。pH 可能有一段時間維持接近正常，所以只靠顏色檢查很容易漏掉黴菌。

黴漿菌。 最危險的一種，因為在一般光學顯微鏡下它不造成混濁、不改變顏色，也看不到任何菌體。培養看起來一切正常，但生長速率下降、飽和密度降低、實驗結果慢慢偏移。黴漿菌無法靠觀察培養基診斷——必須用 PCR、以冷光為基礎的酵素分析或 DNA 染色，這也是為什麼例行檢測是必要而不是選項。

哪些不是汙染。 放在實驗檯上一段時間後變紫，是碳酸氫鹽流失，不是感染。三天前餵過、已經長滿的培養瓶變黃，是正常代謝。從冷到熱的循環之後出現細小的結晶沉澱，通常是磷酸鈣析出，而不是微生物生長。

降低風險。 把培養基分裝成單次工作用量，這樣一次汙染事件不會賠掉一整瓶。倒出來的培養基絕對不要倒回原瓶。抗生素要用得有意識——例行使用青黴素／鏈黴素會把低量細菌汙染壓成看不見的慢性狀態，對黴漿菌又完全無效，因此它可能反而掩蓋了它看似解決的問題。

在代謝研究中預設使用高葡萄糖 DMEM。 25 mM 葡萄糖是藥理濃度而非生理濃度，它會改變代謝表型。

以為 DMEM 是完整培養基。 它不是。沒有血清或設計過的添加物，DMEM 缺少脂質、微量元素、運鐵蛋白與生長因子。

忽略碳酸氫鹽與 CO2 的落差。 如前所述；這在許多實驗室裡默默地折損接種效率。

把 DMEM/F-12 與 DMEM 混用。 兩者在葡萄糖、鈣、碳酸氫鹽、滲透壓與微量元素含量上都不同，其中一種的數據無法套到另一種上。

加了麩醯胺酸卻忘記記日期。 麩醯胺酸分解會產生氨，具毒性而且會累積。請在添加的當下就在瓶上標註。

用錯的濾膜過濾含血清的培養基。 蛋白質會吸附並堵塞濾膜；請使用低蛋白吸附濾膜並加上預濾。

存放在有燈光的層架上。 核黃素與 HEPES 的光降解是真實且可量測的細胞毒性來源。