Trypsin-EDTA

胰蛋白酶是一種絲胺酸蛋白酶。在胰臟中它負責消化食物中的蛋白質；在細胞培養中，它對那些把細胞固定在鄰近細胞與培養器皿塑膠表面上的蛋白質做同樣的事。它專一地切斷離胺酸與精胺酸殘基羧基端的胜肽鍵，而這兩種殘基在黏附蛋白中相當常見，因此只要暴露幾分鐘就足以讓單層細胞脫落。

細胞培養用的胰蛋白酶通常是粗製的豬胰臟胰蛋白酶，以輻射滅菌粉末形式供應，並以活性標示而非純度標示：1:250 代表在特定條件下一份粉末可以消化 250 份酪蛋白。它不是純度等級，1:250 的製劑中除了胰蛋白酶之外還含有其他胰臟蛋白酶。這個混合特性既是粗製胰蛋白酶對堅韌初代組織效果良好的原因，也是它對脆弱細胞比純化或重組酵素更嚴苛的原因。

配方中加入 EDTA 有明確的理由，值得理解而不只是背下來。 主要的細胞黏附系統都依賴二價陽離子。負責細胞與細胞之間黏附的鈣黏蛋白需要鈣離子，才能讓其細胞外區段維持在可以結合的剛性構型；一旦把鈣移除，這些區段就變得鬆軟，黏附隨之失效。負責細胞與基材之間黏附的整合素，則需要二價陽離子結合在其金屬離子依賴性黏附位點上。EDTA 螯合鈣與鎂，同時使這兩套系統失效。

還有第二個比較不明顯的效果。細胞外基質中的二價陽離子會在物理上遮蔽胰蛋白酶需要接觸的胜肽鍵，把它們移除就等於把這些切位暴露出來。所以 EDTA 不只是與胰蛋白酶平行地鬆開黏附——它讓胰蛋白酶本身更有效率。這種協同作用，正是 Trypsin-EDTA 溶液比單獨使用胰蛋白酶更快、所需酵素濃度更低的原因。

同樣的邏輯也解釋了第三個您可能沒想過的成分：基礎溶液一律不含鈣與鎂。 Trypsin-EDTA 就是配製在不含鈣鎂的 HBSS 或 PBS 中，正是為了避免緩衝液把 EDTA 剛移除的離子又補回去。在消化前用含鈣的 PBS 清洗單層細胞，等於推翻了整個配方設計。

百分比指的是胰蛋白酶的重量體積比含量。0.05% 為 0.5 g/L；0.25% 為 2.5 g/L，酵素量相差五倍。

0.05% Trypsin-EDTA 是多數已建立貼壁細胞株的常規選擇——HeLa、CHO、Vero、NIH-3T3、MDCK 等——也適用於任何您希望溫和對待的細胞。Gibco 的 0.05% 產品以 0.5 g/L 胰蛋白酶（1:250）與 0.2 g/L EDTA-4Na 配製於含酚紅、不含鈣與鎂的 HBSS 中。

0.25% Trypsin-EDTA 用於不易脫離的細胞：貼附牢固的細胞株、已經超過匯合而沉積大量細胞外基質的細胞、部分初代培養，以及組織碎片。Gibco 的 0.25% 產品含 2.5 g/L 胰蛋白酶（1:250）與 0.38 g/L EDTA-4Na，基礎溶液相同。Sigma 的同等產品則使用 2.5 g/L 豬源胰蛋白酶與 0.2 g/L EDTA-4Na，配製於含酚紅的 HBSS 中——可見 EDTA 含量會因供應商而異，大致落在 0.4-0.9 mM 的範圍，並不是標準化的數值。

實務上的原則是：使用能讓細胞脫離的最低濃度與最短時間。提高酵素濃度並不能解決脫離太慢的問題；脫離太慢通常是後文所列問題之一的徵兆（血清殘留、試劑太冷、清洗液中含鈣）。需要用 0.25% 消化十分鐘的細胞，就是您正在傷害的細胞。

有些實驗室會保留 0.25% 儲備液，需要時再以不含鈣鎂的 PBS 稀釋成 0.05%。這樣做可行、比較便宜，只要稀釋液無菌且不含鈣就完全可以接受。但請注意，稀釋胰蛋白酶的同時也稀釋了 EDTA，這會改變試劑本身的平衡。

不含 EDTA 的胰蛋白酶 確實存在，也有實際用途：研究中若螯合二價陽離子會干擾所探討的生物現象，或帶入的 EDTA 會毒害後續依賴二價陽離子的酵素時，就會用到它。它讓細胞脫離的速度比複合試劑慢。

要不要含酚紅 是配方選擇，不是功能差異。酚紅讓試劑容易辨識，也方便發現 pH 值問題；在螢光實驗中會因背景干擾而省略，在任何不希望有染劑的後續應用中也會省略。

多數實驗室直接購買現成的 Trypsin-EDTA，但用量大時自行以粉末配製比較便宜；而當您需要市面上沒有人賣的配方時，這也是唯一的選擇。已公開的 Gibco 配方就是要重現的目標。

0.25% Trypsin-EDTA，每公升配方

若要配製 0.05% Trypsin-EDTA，每公升使用 0.5 g 同一種粉末，並搭配 0.2 g/L 的 EDTA 四鈉鹽。

配製步驟

1. 先把基礎溶液冰鎮。 動手之前先把不含鈣鎂的 HBSS 或 PBS 降到 2-8 °C。胰蛋白酶是蛋白酶，會消化自己；配製過程中它處於溫熱又高濃度狀態的每一分鐘，都是在瓶子還沒配好之前就先流失的活性。
2. 先溶解 EDTA。 它很容易溶解，不需要特別處理。
3. 緩慢加入胰蛋白酶粉末，輕輕攪拌，並讓容器保持低溫。不要為了加速溶解而加溫，攪拌也不要劇烈到起泡——蛋白質會在氣液界面變性。
4. 確認 pH 值。 這類溶液通常配製在 pH 7.2-8.0。必要時以稀氫氧化鈉或鹽酸調整。
5. 定容至最終體積，再以 0.22 微米濾膜過濾除菌。 絕對不可高壓滅菌——高溫會把酵素完全破壞。胰蛋白酶溶液容易堵塞濾膜，因此請加裝前置濾膜，並準備比體積推算所需更大的膜面積。
6. 立即分裝成單次使用的體積，並只冷凍一次，於 -30 至 -5 °C 避光保存。這不是可有可無的建議：一瓶被反覆解凍又冷凍的試劑會穩定而不易察覺地流失活性，這正是自製胰蛋白酶被認為不可靠的主要原因。

秤量粉末必須小心。 胰蛋白酶粉末是呼吸道致敏物。請在化學排氣櫃內或有局部抽氣的位置秤量，避免產生粉塵。

水質會直接影響成品。 如果連基礎溶液也要自己配，請使用有標示低內毒素規格的細胞培養級用水。

關於您買到的是什麼。 粉末上的 1:250 標示是活性說明，不是純度等級，不同批次的粗製豬源胰蛋白酶也會有差異。若跨月份的再現性比每公升成本更重要，標有明確活性的現成溶液是比較好的選擇；而重組類胰蛋白酶試劑則完全消除了批次變異的問題。

以下體積是以匯合度 80-90% 的 T-75 培養瓶為準，請依培養面積等比例調整。

1. 試劑回溫。 把 Trypsin-EDTA、不含鈣與鎂的 DPBS 與完全培養基回溫至室溫或 37 °C。胰蛋白酶在 4 °C 的活性只有 37 °C 時的一小部分，而試劑太冷正是細胞「怎麼都消化不下來」最常見的單一原因。
2. 完全移除舊培養基。 全部吸乾。殘留培養基中的血清含有蛋白酶抑制劑，會在您加入胰蛋白酶的瞬間就把它中和掉。
3. 清洗單層細胞。 加入 5-10 mL 不含鈣與鎂的 DPBS，輕輕搖晃後吸除。這一步同時洗掉殘留的血清與殘留的鈣。請使用不含鈣鎂的清洗液——含鈣與鎂的 DPBS 會抵消 EDTA 的作用。通常清洗一次就足夠；若培養時使用高血清培養基則洗兩次。
4. 加入 Trypsin-EDTA。 0.25% 加 2-3 mL，或 0.05% 加 1-2 mL。搖動培養瓶讓試劑覆蓋整個表面；若處理的是敏感細胞，接著把多餘的試劑倒掉大部分——薄薄一層就夠了，試劑用得少，之後要中和的量也少。
5. 於 37 °C 靜置。 多數細胞株為 2-5 分鐘。不要走開。第 2 分鐘時用倒立顯微鏡檢查培養瓶：細胞應該正在變圓並開始脫離。
6. 讓細胞脫落。 當大多數細胞都變圓後，用手掌根部在培養瓶側面用力拍一下，細胞應該會整片脫落。若沒有，請放回培養箱 1 分鐘後再檢查，而不是盲目延長時間。
7. 立即中和。 加入 6-8 mL 含至少 5-10% 血清的完全培養基；若採用無血清操作，則加入等體積、含有明確定義胰蛋白酶抑制劑的溶液。以吸管對著生長面輕柔來回吹打，打散結塊並收集細胞。
8. 離心。 200-300 x g 離心 5 分鐘。轉速更高並不會提高回收率，只會傷害細胞。
9. 重新懸浮與計數。 棄去帶有胰蛋白酶與抑制劑的上清液，把細胞沉澱重新懸浮於新鮮的完全培養基中，以錐蟲藍計數後依所需分盤比例接種。

各種培養容器的 Trypsin-EDTA 建議用量

胰蛋白酶不會自行停止，留在其中的細胞會持續被消化。終止反應有三種方式，而且彼此不能互相取代。

含血清的培養基。 血清含有 α1-抗胰蛋白酶與 α2-巨球蛋白，可直接抑制胰蛋白酶。加入兩到三倍體積、含 5-10% 血清的培養基，基本上可以立即停止反應。這是預設做法，也是在含血清培養中胰蛋白酶消化操作單純的原因。

明確定義的胰蛋白酶抑制劑。 在無血清培養中，加入無血清培養基並不能終止胰蛋白酶——那只是稀釋，細胞仍會持續受損。大豆胰蛋白酶抑制劑（SBTI）是標準的定義化替代方案：它是單一多胜肽，會與胰蛋白酶形成穩定且無酵素活性的一對一複合物，加入量約與現有的胰蛋白酶等莫耳。SBTI 可抑制胰蛋白酶、第 Xa 因子、纖維蛋白溶酶與血漿激肽釋放酶，但對金屬蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶與天門冬胺酸蛋白酶沒有作用——如果您的解離配方中還含有膠原蛋白酶或 dispase，這一點值得知道。

單靠稀釋，只有對本來就設計成如此的試劑才足夠。TrypLE 這類重組類胰蛋白酶試劑經稀釋即失活，不需要抑制劑，這也是它們在無血清與無動物來源流程中相當方便的原因之一。請不要假設傳統豬源胰蛋白酶也有同樣的行為。

無論採用哪一種方式，都請以離心並重新懸浮於新鮮培養基的方式移除抑制劑。 把胰蛋白酶與抑制劑留在接種懸浮液中，等於把蛋白質與蛋白酶抑制活性帶進下一次繼代，其中殘留的 SBTI 尤其可能影響後續實驗。

過度胰蛋白酶消化。 最常見也最傷細胞的錯誤。表現包括繼代後存活率低、下次接種時貼附不良或很慢、顯微鏡下細胞呈顆粒狀或出現膜泡，以及溶解細胞釋出 DNA 造成的結塊。比較不明顯的是，胰蛋白酶會切斷細胞表面蛋白——細胞外側的受體與標記和其他蛋白一樣都是受質。若某個流式細胞術套組的標記在胰蛋白酶消化後消失，而同一批細胞單獨以 EDTA 收取時仍然存在，那就是酵素切掉了抗原決定位。要做表面標記的工作，請改用純 EDTA 解離或更溫和的試劑，或讓細胞在培養基中恢復 30-60 分鐘後再染色。

消化不足。 部分細胞仍然貼附著。這不是無害的結果：先脫離的細胞並不是隨機取樣，因此反覆的消化不足會在許多次繼代之後悄悄篩選出某個亞群。請把整層細胞都收下來，否則就重做。

血清殘留——胰蛋白酶「沒作用」的頭號原因。 任何殘留的含血清培養基都會在接觸的瞬間中和胰蛋白酶。請徹底吸乾並清洗。若脫離速度異常地慢，這是第一個該檢查的地方，不要先去提高濃度或延長時間。

清洗液中含鈣。 在加入 Trypsin-EDTA 之前用含鈣與鎂的 DPBS 清洗，等於把 EDTA 存在的目的所要移除的離子重新加回去。請使用不含鈣鎂的配方。

試劑太冷。 冷藏溫度下的胰蛋白酶反應遲鈍，請先回溫。

培養過度匯合。 超過匯合度的細胞會鋪下大量細胞外基質，變得越來越難收取，誘使人延長消化時間而傷害細胞。請在單層細胞完全匯合之前就進行繼代。

反覆凍融。 胰蛋白酶本身是蛋白酶，會消化自己。每一次凍融循環都會損失活性，一瓶被解凍又冷凍五次的試劑，行為將難以預測。收到後就分裝成單次使用的體積，只冷凍一次。

重複使用胰蛋白酶。 請不要。除了把接觸過細胞的試劑倒回儲備瓶所帶來的明顯汙染風險之外，用過的胰蛋白酶活性也是未知的——一部分已被受質消耗，一部分已被帶入的血清抑制。

EDTA 帶入後續酵素步驟。 EDTA 會螯合金屬蛋白酶所需的二價陽離子。把 Trypsin-EDTA 處理過的細胞直接送進膠原蛋白酶或 dispase 消化，會抑制這些酵素，有時甚至完全失效。請在兩個步驟之間以含二價陽離子的緩衝液清洗。

豬胰臟胰蛋白酶是動物來源的試劑，這在三個層面上很重要：細胞治療與生物製劑生產的法規要求、粗製組織萃取物本身固有的批次間變異，以及外源感染因子的理論風險。以下幾種替代方案可以處理這些問題。

重組類胰蛋白酶蛋白酶。 以微生物發酵生產而非從胰臟萃取，得到的是單一明確的酵素而不是蛋白酶混合物。其解離動力學與豬源胰蛋白酶相當，但細胞毒性較低；它們在室溫與冷藏條件下都穩定，不需要冷凍保存，而且單靠稀釋就能使其失活，因此不需要血清或抑制劑。在無血清流程中，它們是傳統胰蛋白酶最直接的替代品。

純 EDTA 解離（Versene）。 一種單純的螯合劑溶液，典型組成是不含鈣鎂的 PBS 中含 0.5 mM EDTA，完全不含酵素。因為沒有任何東西被切斷，表面蛋白得以完整保留——當後續的流式細胞術分析依賴表面抗原決定位時，這就是首選試劑。它也是人類多能幹細胞以團塊方式繼代的標準做法，因為酵素性的單細胞解離會造成問題。代價是速度較慢、對貼附牢固的細胞完全無效，而且細胞是以片狀與團塊的形式脫落，不是單細胞懸浮液。

無酵素、化學定義的解離培養基。 這類配方把螯合作用與其他非酵素機制結合，比單用 EDTA 更一致，同時保持表面蛋白完整。

Accutase 類試劑。 具有非哺乳動物來源的混合蛋白水解與膠原水解活性。對許多細胞類型比粗製胰蛋白酶溫和，廣泛用於幹細胞與神經元；不過在部分系統的直接比較中，重組類胰蛋白酶試劑的存活率表現優於 Accutase。

如何取捨，取決於您需要保住什麼。若是表面抗原決定位，請用 EDTA 或無酵素試劑。若是法規符合性與再現性，請用重組酵素。若是要快速處理難搞的初代培養，粗製的 0.25% Trypsin-EDTA 仍然佔優勢——它嚴苛正是因為它是多種蛋白酶的混合物，而有時候組織就是需要這樣。

液態 Trypsin-EDTA 通常冷凍保存，一般為 -30 至 -5 °C 避光存放，保存期限約 24 個月。解凍後，工作瓶置於 2-8 °C 可維持數週的可用活性，但活性會因自體分解而持續下降；請標註解凍日期。

收到後立即分裝。 把整瓶解凍一次，依您實際的使用方式分裝成單次用量，再重新冷凍。這是處理胰蛋白酶時最有價值的單一習慣，因為它消除了讓實驗結果在數月之間逐漸偏移的凍融活性損失。

重組類胰蛋白酶試劑一般在 2-8 °C 穩定，常常在室溫下也穩定，完全免除了凍融問題，這是它們實務上的優點之一。

無菌性。 本試劑經過過濾除菌，不含防腐劑。它會直接接觸細胞，是汙染進入原本乾淨培養物的常見途徑。請用傾倒的方式取用，不要把吸管伸進儲備瓶；用剩的試劑不要倒回去；看起來混濁的瓶子一律丟棄。

pH 值與酚紅。 含 EDTA 的胰蛋白酶溶液通常配製在 pH 7.2-8.0。在含酚紅的配方中，瓶子變黃代表 pH 值已經下降，這通常表示它被汙染或在溫暖環境下放太久——請丟棄。

個人防護。 胰蛋白酶粉末是呼吸道致敏物，秤量時應在有抽氣的環境下進行；現成溶液的危害性低。實驗室使用的任何動物來源材料都適用一般標準操作規範。