用血球計數盤計數細胞

細胞培養實驗室使用的血球計數盤幾乎都是 改良式 Neubauer 規格。它是一片厚玻璃載片，中央有兩個拋光的計數平台，各刻有一組完全相同的格線，平台之間以溝槽隔開。兩側墊高的肩部讓蓋玻片剛好架在刻線表面上方 0.1 mm 處，正是這個固定深度，把平面上的計數變成體積的測量。

刻線區域為 3 mm x 3 mm = 9 mm2，劃分成 九個 1 mm x 1 mm 的大格：

• 四個角落大格 各再細分為 16 個 0.25 x 0.25 mm 的小格，哺乳動物細胞計數用的就是這四格。
• 中央大格 細分為 25 個 0.2 x 0.2 mm 的中格，每個中格再分成 16 個 0.05 x 0.05 mm 的小格，合計 400 個小格。這組較細的刻線是為紅血球、血小板這類體積小而數量龐大的顆粒設計的。

各區體積直接由面積乘以 0.1 mm 深度得出：

1 x 10^-4 mL 這個數字，就是那個著名的 x 10^4 因子的由來。 在一個角落大格中數到的細胞數，等於在一萬分之一毫升裡數到的細胞數，所以乘以 10,000 就換算成每毫升細胞數。這個因子沒有別的來歷，而且換成深度不同的計數室時它就會改變——有些拋棄式計數室深度是 0.02 mm 或 0.1 mm，對應的乘數不同，包裝上都會標示。

在這款改良式計數盤上，1 mm2 大格的邊界是以 三條平行線 畫成的，計數時 以三條線中間那一條為界。這是一個常見而不易察覺的誤差來源：數到最外側那條線會放大面積，連帶把計數高估幾個百分點。

1. 清潔計數盤與蓋玻片：以 70% 酒精擦拭並用無棉絮拭紙擦乾。務必使用計數盤隨附的厚磨砂蓋玻片，不要用一般顯微鏡蓋玻片——普通蓋玻片會下彎，計數室深度就不再是 0.1 mm。
2. 架好蓋玻片：對著肩部輕輕呵氣使其微濕，再把蓋玻片穩穩壓下。位置正確時，玻璃與玻璃接觸處會出現 牛頓環（淡淡的干涉條紋）。這是確認計數室深度正確的唯一可靠依據。
3. 做出真正的單細胞懸浮液：有細胞團塊，計數就失去意義。要充分以胰蛋白酶消化、輕柔吹打分散，若該細胞株容易聚集，就再過一次細胞篩網。
4. 取樣前立刻混勻：細胞一分鐘內就會沉降。上下吹打或把離心管倒轉數次，隨即從中段深度取出所需體積。
5. 以錐蟲藍稀釋：標準做法是 1:1 混合——例如 50 微升細胞懸浮液加 50 微升 0.4% 錐蟲藍，稀釋倍數為 2。輕輕混勻後 在 3-5 分鐘內完成計數：錐蟲藍具細胞毒性，混合液久置後活細胞也會開始吸入染劑，存活率會偏低失真。
6. 加樣：取 約 10 微升，把吸管尖端輕觸蓋玻片邊緣的凹槽，讓毛細作用把樣品吸入。每一側計數室都要一次連續填滿。
7. 檢查充填狀況：刻線區應被均勻覆蓋且無氣泡。若液體溢入溝槽，表示蓋玻片已被浮起、脫離肩部，深度就是錯的——清潔、擦乾後重新加樣。填不滿則會留下乾涸區域，使計數往另一個方向偏差。
8. 靜置約 1 分鐘 再開始計數，讓細胞落在同一個焦平面上。

培養的哺乳動物細胞，數四個 1 mm2 的角落大格。 有些實驗室會加數中央大格，總共數五格。兩種慣例都成立；不成立的是中途更換，因為兩者的取樣統計性質不同。

壓線規則 的存在，是因為壓在刻線上的細胞否則會被相鄰兩格各數一次，或兩格都不數。規則很簡單：

數壓到 相鄰兩邊 的細胞（形成一個「L」形），另外兩邊上的細胞一律不數。

最常見的慣例是 納入上緣與左緣、排除下緣與右緣；鏡像慣例（納入上緣與右緣）同樣正確。選定一種、寫進標準作業程序，並確保每一格、每一位操作者都照樣執行。判斷依據是細胞 本體大部分 落在三條刻線中間線的哪一側。

實務上還有兩條規則同樣重要：

• 兩側都要數：兩個計數室都要加樣並計數，兩邊結果應相差在 10% 以內。若差距更大，代表懸浮液沒有混勻、計數室充填不均，或細胞正在結塊——這時應該重新加樣，而不是把一組壞數據平均掉。
• 密度區間：目標是 每個 1 mm2 角落大格約 25 到 100 個細胞，相當於稀釋後約 2.5 x 10^5 到 1 x 10^6 細胞/mL 的懸浮液。低於每格約 25 個時，取樣雜訊會主導結果；高於約 100 個時，細胞開始重疊而被系統性低估。懸浮液太濃就再稀釋，並把額外的倍數記錄下來。

精確度的極限來自統計，而不是操作者的用心程度。細胞計數服從卜瓦松統計，變異係數約為 1/√N，其中 N 是所數細胞的總數。數 100 個細胞的變異係數約 10%；數 200 個約 7%；數 400 個約 5%。 只數一格 30 個細胞時，再怎麼小心也突破不了這個極限——要讓數字更緊，唯一的辦法就是多數一些細胞。

公式如下：

每毫升細胞數 =（所數細胞總數 ÷ 所數大格數）x 稀釋倍數 x 10^4

稀釋倍數是總體積除以其中細胞懸浮液的體積。與錐蟲藍 1:1 混合時，稀釋倍數是 2，不是 1。這是細胞計數中最常見的算術錯誤。

實例演算。 一瓶 T-75 培養瓶的 HeLa 細胞經胰蛋白酶消化後，以 10.0 mL 完全培養基重新懸浮。取 50 微升懸浮液與 50 微升 0.4% 錐蟲藍混合（稀釋倍數 = 2），再取 10 微升加樣。四個角落大格的計數結果為：

存活細胞濃度

84.0 x 2 x 10^4 = 1.68 x 10^6 存活細胞/mL

總濃度（存活 + 死亡）

(84.0 + 4.5) x 2 x 10^4 = 1.77 x 10^6 細胞/mL

收獲的存活細胞總數

1.68 x 10^6 細胞/mL x 10.0 mL = 1.68 x 10^7 個存活細胞

存活率

336 / (336 + 18) x 100 = 94.9%

請注意，稀釋倍數在存活率的計算中會互相抵消，所以那條式子裡不會出現它。另外，數了 336 個細胞的變異係數約為 5.5%，因此濃度應該報成 1.7 x 10^6 細胞/mL——寫成 1.68 x 10^6 等於宣稱了這個方法沒有的精確度。

每個角落大格落在 76 到 91 個細胞之間，位於 25-100 的區間內，因此不需要再稀釋。

錐蟲藍是一種陰離子偶氮染料，無法通過完整的細胞膜。膜完整性受損的細胞會吸入染料，呈現明顯的藍色、常常還腫脹；活細胞把它排除在外，看起來明亮、有折光、邊緣清晰。標準工作液是生理食鹽水或 PBS 中的 0.4%（w/v） 溶液。

它量到的其實是 細胞膜完整性，這比日常所說的「存活率」窄得多。已經走上凋亡途徑但細胞膜仍完整的細胞，在錐蟲藍下算活的；在胰蛋白酶消化過程中被機械性破壞的細胞則算死的，即使它所屬的族群十分健康。錐蟲藍排除法適合用來檢查例行收獲的品質，卻不適合用來衡量細胞毒性實驗的結果——後者需要凋亡專一性或代謝性的分析方法。

實務要點：

• 時間很重要：混合後 3-5 分鐘內完成計數。錐蟲藍本身有毒，暴露時間拉長會殺死細胞，把存活率的數字一路往下拖。
• 蛋白質會干擾：錐蟲藍會結合血清蛋白，使背景染色、更難分辨。若背景藍得厲害，先把細胞洗到 PBS 中再計數。
• 應該高於 90%：健康的對數生長期培養、乾淨收獲下來，存活率應在 90% 以上。若落在 70-85%，代表胰蛋白酶消化過度、培養瓶過度匯合、吹打太粗暴，或培養本身出了問題，值得在使用這批細胞前先查清楚。
• 碎屑不是死細胞：細小、形狀不規則的藍色碎片是膜碎屑，不應計入。只數大小與形態合理的細胞。

計數只有換算回「該吸多少體積」才有用。延續上面的實例，懸浮液濃度為 1.68 x 10^6 存活細胞/mL。

任務： 以 每孔 2 x 10^5 個細胞、每孔 2 mL 培養基 接種一塊 6 孔培養盤。

1. 目標濃度：2 mL 中 2 x 10^5 個細胞 = 1 x 10^5 細胞/mL。
2. 所需總體積：六孔 x 2 mL = 12 mL。多配一點以涵蓋吸取損耗，配 13 mL。
3. 所需細胞總數：13 mL x 1 x 10^5 細胞/mL = 1.3 x 10^6 個細胞。
4. 應取的原液體積：1.3 x 10^6 / 1.68 x 10^6 細胞/mL = 0.774 mL = 774 微升。
5. 配製：把 774 微升細胞懸浮液加入 12.23 mL 預溫的完全培養基中，輕輕混勻，每孔分注 2 mL。
6. 均勻分布：放入培養箱前，把培養盤前後搖動再左右搖動。畫圈搖晃會把細胞趕到每個孔的正中央。

同樣的算術支撐了計數的所有下游用途：以固定的每平方公分細胞數擴增到培養瓶、以固定的每毫升細胞數分裝凍存管，以及接種分析用培養盤。把每毫升細胞數當成工作數字，最後再換算一次。

細胞團塊。 危害最大的失誤，因為它讓計數產生偏差卻看起來不像錯誤。結塊的細胞會被低估，接種密度因此偏低，結果也就無法重現。成因包括消化不完全、破裂細胞釋出的 DNA，以及混合不足。解決方式是稍微延長消化時間、在中和培養基中加入 DNase、輕柔吹打分散，或過篩網。不要勉強去數一份結塊的懸浮液，重新製備。

液體流入溝槽。 蓋玻片已被浮起，計數室深度不再是 0.1 mm，由此推算出來的每一個數字都是錯的。清潔、擦乾、重新架好蓋玻片直到牛頓環出現，再重新加樣。

每格細胞太少。 低於每個角落大格約 25 個時，卜瓦松誤差會淹沒整個測量。把懸浮液濃縮，或多數幾格並相應調整除數。

每格細胞太多。 高於每個角落大格約 100 個時，細胞重疊而被低估。稀釋後把額外倍數乘進計算式。紀錄上應該寫下完整的稀釋鏈，而不只是最後那一步錐蟲藍。

忘記錐蟲藍的稀釋倍數。 會讓每個結果都減半。如果接種密度剛好是預期的一半或兩倍，先檢查稀釋倍數。

同一側計數室數兩次當成重複。 重新加樣再數同一側，測的是你的眼睛，不是懸浮液。真正的重複是兩側計數室，而且樣品要重新混勻。

計數期間細胞在管中沉降。 第二次吸取的樣品會比第一次稀。每次加樣前都要立刻混勻。

操作者之間壓線規則不一致。 同一份懸浮液由不同人來數會出現系統性偏差，通常是幾個百分點。把慣例寫下來。

計數盤髒污或刮傷。 刻線區的碎屑，疲累的眼睛會當成細胞，某些自動化系統也一樣。用酒精和無棉絮拭紙清潔，絕不可用有磨蝕性的材料——刻線是蝕刻上去的，一旦損壞就無法復原。

血球計數盤至今屹立不搖，是因為它便宜、只要 10 微升樣品、不需校正，而且讓操作者親眼看見樣品。最後這點並不瑣碎：結塊、碎屑、汙染與異常形態，在手工計數時全部看得見，而在儀器回傳的一個數字裡全部看不見。

它的弱點是通量與操作者依賴性。每個樣品要花上幾分鐘，而不同操作者採用不同的壓線慣例、對「什麼算一個細胞」有不同判斷時，彼此的差距會超過統計誤差。

自動化影像式計數儀 在拋棄式計數片中執行同一套錐蟲藍化學反應，再套用固定的演算法，因而排除了操作者偏差，每個樣品不到一分鐘。大量例行計數選它是對的。它繼承了血球計數盤的盲點——一樣會數錯團塊——而且每換一種細胞型態都需要對照手工計數重新驗證，因為大小與圓形度的判定門檻是依典型哺乳動物細胞設定的。

阻抗式（Coulter 原理）計數儀 每次可數上千顆粒子，總顆粒數的精確度極佳，但它是依大小、而非依細胞膜完整性來分辨，因此不提供存活率，也會把大小接近的碎屑當成細胞。

流式細胞儀 搭配存活率染劑，可提供單細胞層級的多參數資料，並能區分凋亡與壞死族群。它需要更多樣品、更多前置設定與更多分析，而且絕對濃度必須靠計數微球或體積式儀器才能得到。當問題是「細胞處於什麼狀態」而不只是「有多少個」時，就該用它。